As enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) fazem parte dos sistemas antioxidantes nos seres vivos. A alteração da atividade da CAT e SOD extraídas de organismos expostos a poluentes químicos tem sido estudada na avaliação ecotoxicológica. São apresentados os resultados preliminares referentes à implementação de metodologias para avaliar as atividades de SOD e CAT frente à possível ação de diversos poluentes de origem agrícola. As metodologias empregadas demonstraram ser satisfatórias para estudos do potencial das enzimas no desenvolvimento de biossensores. Entretanto, alguns ajustes metodológicos poderão ser realizados com relação a uma melhor adaptação às condições laboratoriais

CASTRO, V. L. S. S. de

GRANERO, G.

JONSSON, C. M.

TESSARI, C. M.

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Jr! Workshop de Rede de Nallotecl!ologia Aplicada ao Agronegócio METODOLOGIAS DE ANÁLISE DA ATIVIDADE DE DUAS ENZIMAS COM POTENCIAL USO EM BIOSSENSORES Claudio M. Jonsson*, Vera L.S. de Castro, Christina M. Tessari, Gustavo Granero Embrapa Meio Ambiente. Jaguariúna, SP *jonsson@cnpma.embrapa.br Projeto Componente: PC2 Plano de Ação: 01.05.1.01.02.02 Resumo As enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) fazem parte dos sistemas antioxidantes nos seres vivos. A alteração da atividade da CAT e SOD extraídas de organismos expostos a poluentes químicos tem sido estudada na avaliação ecotoxicológica. São apresentados os resultados preliminares referentes à implementação de metodologias para avaliar as atividades de SOD e CAT frente à possível ação de diversos poluentes de origem agrícola. As metodologias empregadas demonstraram ser satisfatórias para estudos do potencial das enzimas no desenvolvimento de biossensores. Entretanto, alguns ajustes metodológicos poderão ser realizados com relação a uma melhor adaptação às condições laboratoriais. Palavras-chave: biossensor, catalase, superóxido dismutase hatrodução .-\5 enzimas catalase (CAT) e superóxido .nsmutase (SOD) fazem palte dos sistemas :mtioxidantes nos seres vivos pela sua capacidade .i! neutralizar a ação de espécies reativas de oOugênio como a do anion superóxido e do peróxido de hidrogênio. Estas moléculas Wrnente reativas fazem parte de subprodutos do lirUbolismo normal e desempenham papel irnp<mante nos processos de sinalização celular. &trretanto, em situações de estresse celular, as ~.:ies reativas de oxigênio podem aumentar ~itlcativamente levando a danos celulares ",-mo alteração do DNA, peroxidação de lipídeos " 0xidação de aminoácidos nas proteínas 1. P;:orumto. a alteração da atividade da CAT e SOD ,,=idas de organismos expostos a poluentes .:;mmicos de diversas origens tem sido alvo de estudo na análise de risco e monitoramento de áreas degradadas 2 Nesse sentido, Farines e colaboradores 3 testaram "in vitro" a capacidade de estrógenos fenólicos naturais e sintéticos em modular a SOD bovina; constatando que para alguns compostos a inibição da atividade era superior ou equivalente a -90% na concentração de lOOIlM dos compostos. A mesma enzima, mas originária de eritrócitos, é inibida "in, vitro" pela hidrazida maleica na concentração de - 40 IlM 4 Alguns compostos tipicamente inibidores da CAT, entre estes, metais pesados Como os sais de cianeto, tem a capacidade de inibir a enzima de origem microbiana em níveis menores de 10 11M. Para alguns desses compostos, como por exemplo, a azida sódica; têm sido propostos biossensores a base de CAT 5 Do mesmo modo biossensores a base de SOD tem sido propostos onde a atividade enzimática é Embrapa Soja, Londrina, 15 e 16 de outubro de 2007 7 ]'2 Workshop de Rede de NClllotecT1ologia Aplicada ao Agronegócio modulada pela presença de radicais superóxido 6. Apesar de um significativo volume de dados da literatura a respeito de alteração das atividades de SOD e CATem organismos expostos aO estresse de agroquímicos e outros poluentes de origem agrícola (estudos "in vivo"), existe uma carência de resultados de testes "in vitro". Entretanto, tanto para os estudos "in vivo" como "in vitro", os dados ainda são escassos frente ao grande número de princípios ativos existentes. Os resultados destes estudos "in vitro", nos quais se mede a modulação da atividade enzimática pela adição do xenobiótico em um sistema de reação contendo a enzima e seu substrato, proporcionariam bases para o desenvolvimento de biossensores cujo funcionamento se fundamente na alteração da atividade de SOD e CAT. No presente trabalho são apresentados os resultados preliminares realizados no Laboratório de Ecotoxicologia e Biossegurança no que se refere à implementação de metodologias para avaliar as atividades de SOD e CAT, enzimas que serão testadas frente à possível ação de diversos poluentes de origem agrícola. Materiais e métodos A atividade da SOD foi avaliada de acordo com a metodologia proposta por Ukeda e colaboradores " em meio contendo 50 mM de tampão fosfato pH 8,0 juntamente com solução 3mM de xantina; solução 3mM de EDTA, solução 0,75mM de X'IT e SOD (de leite bovino) em diferentes concentrações. A reação foi iniciada pela adição de xantina oxidase. A absorvâncía da cor púrpura desenvolvida foi medida em um espectrofotômetro Beckman DU-8B no comprimento de onda de 470 nm. A velocidade da reação em termos de mudança de absorvãncia em função do tempo (<'>Abs Imin) foi calculada por regressão linear simples. A atividade da CAT foi medida segundo a metodologia descrita por Aebi " utilizando-se solução de peróxido de hidrogênio como substrato em solução de tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A reação foi iniciada pela adição da CAT de fígado bovino sendo que a absorvância foi monitorada em vários intervalos no comprimento de onda de 240 nm, utilizando-se um espectrofotômetro Shimadzu UV 1605 Pc. A adição do inibidor de CAT, a azida sádica, nas suas concentrações finais de 100, 10 e I mM foi avaliada. A velocidade da reação foi calculada coma descrito anteriormente. Resultados e discussão A metodologia de análise de SOD se fundamente em que a enzima xantina oxidase, tendo cOmo se:. substrato a xantin:j e na presença de O2, formar::·. um sistema gerador de anions superóxido (O,' Estas espécies reativas de oxigênio, na presenç.:; de um cromóforo como o XTT (sal de tetrazólio reduzem este composto para formar um derivad,: de formazano que absorve luz no comprimento de onda de 470 nm. Entretanto esta redução é inibide na presença de SOD pelo fato de requerer O,' para formar peróxido de hidrogênio na presenç2 de cátions H+. Na Tabela I estão apresentados os resultados d, um teste onde se avaliou a viabilidade cL metodologia a ser adotada na análise da atividade de SOD nos futuros estudos a serem realizado' com diferentes substâncias poluentes de origer:. agrícola. Analogamente, na Figura 1 estão apresentados c, resultados de um teste de avaliação de uso cL metodologia proposta para os futuros ensaios cor:. CATem presença dos xenobióticos. Tabela J: Velocidade de redução de XTT L ausência e na presença de díferente~ concentrações de SOD. Concentração de SOD (U/mL) 0,00 0,45 0,90 2,26 Velocidade da reação <<'>Abs470....Imin) 0,0075 0,0029 0,0016 0,0015 Os resultados da Tabela demostraram_ diminuição da redução do XTT em função c.:. concentração de SOD, sugerindo-se que exis:.:.. uma concentração em que esse fenômeno 5:-mantenha estável, /mesmo aumentando-se concentração desta enzima. O aumento '-_ absorvância nos 20 min iniciais da reação ausência de SOD foi equivalente aproximadamente 0,12; estando de acordo com:' resultados de Ukeda e colaboradores'. Os resultados da Figura I mostraram a diminuiç~: da absorvância do peróxido de hidrogênio e~ aproximadamente 60%, para o tempo de reação é, 130 segundos, evidenciando assim o consumo c ~ substrato pela CAT. A absorvância inicial :._ reação foi de aproximadamente 0,2, ou seja dent:. da faixa de análise. Entretanto, a ação de;:_ Embrapa Soja, Londri1Za, 15 e 16 de outubro de 2007 8 • 3ª WorkS/lOp de Rede de Na/lOTeCnologia Aplicada lIO Agrol1egócio ~nzima foi inibida na presença da azida sódica nas :r~5 concentrações testadas. o 20 40 60 80 100 120 140 len-po (seg) Figura 1: Absorvância (240 nm) do peróxido de llidrogênio em função do tempo de reação com C~T. na ausência (+) e na presença de azida <Ódica nas concentrações de 100 (.) ; 10 ("') e I • J.' mM. Os valores são relativos a absorvância ilicial, que foi tomada como 100%. Conclusões C<lIIl base nos dados obtidos até o momento, as -"odologias aqui propostas para a avaliação da ahidade de SOD e CA T demonstraram ser Sllisfatórias para o uso em estudos com agentes ""oentes de origem agrícola. Entretanto, alguns ~"s poderão ser realizados com relação a uma -umr adaptação às nossas condições IIixlratoriais. ~erências I "'ORTH, A, c.; BAILEY, B. (Ed). The -.ndbook of Oxidative Metabolism. OIelmsford: ESA Inc, 1995. :!P.-\..'\TIEY. S.; PARVEZ, S.; SAYEED, 1.; . B..-\Ql'E, R.; BIN-HAFEEZ. B.; RAISUDDIN. S . .... ""1I113.rkers af oxidative stress: a comparative study of river Yamuna tish Wallago attu (BI. & Schn.). Sei Total Environ. [S. 1.], v. 309, p. 105-115,2003. 3 FARINES, V.; MONJE, M. c.; TELO, J. P.; HNA WIA, E.; SAl!V AIN, M.; NEPVEU, F. Polyphenols as superoxide dismutase modulators and ligands for estrogen receptors. Analytica Chimica Acta, [S. 1.], v. 513, p. 103-111,2004. 4 DOWLA, H. A.; PANEMANGALORE, M.; BYERS, M. E. Comparative inhibition of enzymes of human erythrocytes and plasma in vitro by agricultural chemicals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., [S. 1.], v. 31, p. 107-114, 1996. 5 SEZGINTURK, M. K.; GOKTUG, T.; DINÇKA Y A, E. A biosensor based on catalase for determination of highly toxic chemical azide in fruit juices. Biosensors and Bioelectronics, [S. 1.], v. 21, p. 684-688,2005. 6 CAMPANELLA, L.; PERSI, L.; TOMASSETTI, M. Superoxide and nitric oxide radicais as modulating agents of enzymatic sensar responses. In : WORKSHOP ON CHEMICAL SENSORS AND BIOSENSORS, 2. [Anais •.• ]. Rome: University of Rome "La Sapienza", Chemistry Department, 1999. 7 UKEDA, H.; MAEDA, S.; ISHlI, T.; SAW AMURA, M. Spectropholornetric assay for superoxide disrnutase based on tetrazoliurn salt 3'--1--(phenylamino)-carbon yl--3, 4-tetrazoliurn]-bis( 4-rnethox y-6-nitro )benzenesulfonic acid hydrate reduction by xanthine-xanthine oxidase. Anal. Biochem., [S. 1.], v. 251, p. 251,206-209, f997. 8 AEBI, H. E. Catalase. In: BERGMEYER, H.U. Methods ofenzymatic analysis. 3 Ih ed. Weinheim: Verlagchemie GmbH, 1983. v. 3. Embrapa Sojo, Londrina, /5 e J 6 de outubro de 20U7 9 

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