COLNAGO, L. A.

SANTOS, P. M. dos

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Quim. Nova, Vol. 33, No. 4, 954-956, 2010Nota Técnica*e-mail: colnago@cnpdia.embrapa.brSUPRESSÃO DAS ANOMALIAS DE FASE E BATIMENTOS LATERAIS EM ESPECTROS DE RMN 13C OBTIDOS COM A SEQUÊNCIA DE PRECESSÃO LIVRE NO ESTADO ESTACIONÁRIOPoliana Macedo dos SantosInstituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, CP 780, 13560-970 São Carlos – SP / Embrapa Instrumentação Agropecuária, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, CP 741, 13560-970 São Carlos – SP, BrasilAndré Alves de SouzaInstituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, CP 369, 13560-970 São Carlos – SP, BrasilLuiz Alberto Colnago*Embrapa Instrumentação Agropecuária, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, CP 741, 13560-970 São Carlos – SP, BrasilRecebido em 30/3/09; aceito em 23/11/09; publicado na web em 9/3/10SUPPRESSION OF PHASE ANOMALIES AND SIDEBANDS ON 13C NMR SPECTRA OBTAINED WITH THE STEADY-STATE FREE PRECESSION SEQUENCE. The Steady-State Free Precession (SSFP) sequence has been widely used in low-field and low-resolution imaging NMR experiments to increase the signal-to-noise ratio (s/n) of the signals. Here, we analyzed the Scrambled Steady State - SSS and Unscrambled Steady State - USS sequences to suppress phase anomalies and sidebands of the 13C NMR spectrum acquired in the SSFP regime. The results showed that the application of the USS sequence allowed a uniform distribution of the time interval between pulses (Tp), in the established time range, allowing a greater suppression of phase anomalies and sidebands, when compared with the SSS sequence.Keywords: 13C NMR; Steady State Free Precession; phase anomalies and sidebands.INTRODUÇÃOA sequência de Precessão Livre no Estado Estacionário (Steady-State Free Precession – SSFP) tem sido muito empregada na res-sonância magnética nuclear (RMN) de baixo campo e de imagem para análises rápidas com aumento na razão sinal-ruído (s/r).1-8 Esta sequência apresenta como principal vantagem a utilização de intervalos de tempo entre os pulsos (Tp) menores que os tempos de relaxação longitudinal (T1) e transversal (T2). Este decréscimo de Tp possibilita realizar a promediação de milhares de espectros por unidades de T1, proporcionando um ganho significativo na razão s/r, quando comparada com as demais sequências utilizadas na RMN.2 Na sequência SSFP, cada pulso aplicado é responsável por dois processos simultâneos: a excitação da magnetização longitudinal, gerando um FID logo após o pulso, e a refocalização da magnetização transversal residual, sob a forma de um eco. Ao efetuar a transformada de Fourier do sinal, observa-se que o espectro apresenta anomalias de fase, amplitude e batimentos laterais, devido à presença do eco no sinal no domínio do tempo,9,10 que inviabilizam o seu uso em análises de RMN de rotina em alta resolução.Para suprimir estas anomalias, Ernst e Anderson9 propuseram a utilização de um Tp maior que 3T2. Nesta condição (Tp > 3T2), a componente eco formada apresenta apenas 5% da intensidade total. Freeman e Hill10 propuseram um método para supressão das ano-malias de fase e batimentos laterais, que se baseava na eliminação da componente eco ao promediar sinais adquiridos com diferentes valores de Tp. Esta sequência foi denominada de Scrambled Steady State - SSS, sendo as variações de Tp realizadas aleatoriamente, após a aplicação de 64 pulsos, necessários para o completo estabelecimento do regime de estado estacionário. Rudakov e colaboradores11 sugeri-ram uma sequência na qual a supressão da componente eco ocorria ao efetuar variações de 180° nas fases dos pulsos, após a aplicação de dois pulsos consecutivos. Schwenk12,13 desenvolveu a sequência denominada Quadriga Fourier Transform – QFT, a qual suprimia as anomalias de fase ao se promediar quatro espectros adquiridos com diferentes frequências de irradiação.No entanto, essas propostas não foram adotadas pelos usuários de RMN. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar as metodolo-gias existentes para a eliminação das anomalias de fase e batimentos laterais dos espectros de RMN obtidos com a sequência SSFP, bem como propor uma sequência mais eficiente para esse fim, denominada Unscrambled Steady State – USS. Nesta sequência, a variação de Tp é realizada em passos constantes, o que possibilita uma supressão mais eficiente e reprodutível das anomalias, quando comparada com as propostas na literatura.  PARTE EXPERIMENTALOs espectros de RMN de 13C foram adquiridos em um espectrôme-tro Varian Inova com ímã de 9,4 T, cujas frequências de ressonância são de 400 MHz para o núcleo de 1H e 100,5 MHz para o núcleo de 13C.A amostra estudada foi acetato de etila, dissolvida em clorofórmio deuterado e analisada pelas sequências SSFP, SSS e USS, propostas nesse trabalho. Para a aquisição dos sinais com a sequência SSFP, aplicou-se um trem de pulsos de 60° de mesma fase, separados por um Tp = 300 ms, que corresponde à utilização de um tempo de aquisição (at) de 299,7 ms e tempo de reciclo (Tr) de 0,3 ms (Tp = at + Tr). Para as sequências SSS e USS, aplicou-se um trem de pulsos de 60° de mesma fase, com at de 299,7 ms  e  valores  de  Tr  variando entre 0,3 e 1,3 ms (DTp = DTr = 1 ms), cuja escolha foi realizada dentro do intervalo de tempo equivalente à variação de 0 a 180° na fase da componente eco, que é determinada pela frequência de offset (nr) utilizada. O valor escolhido, 500 Hz, faz com que os spins nucleares perfaçam, no sistema de referencal girante, uma rotação completa em torno do campo magnético efetivo em 2 ms; logo, para se obter a inversão de fase da componente eco de 180º, a variação de Tp deve ser da ordem de 1 ms (1/2nr), tal como aplicado.Ainda, para uma eficiente supressão da componente eco, e conse-quentemente das anomalias de fase e batimentos laterais, a frequência de offset (nr) tem que ser diferente da frequência de ressonância (n0) Supressão das anomalias de fase e batimentos laterais 955Vol. 33, No. 4dos sinais a serem analisados, ou seja, ela não pode ser igual a zero para nenhum dos sinais. Caso algum sinal esteja em ressonância, o seu eco não será suprimido, uma vez que o mesmo manterá sua coerência de fase para todos os valores de Tr utilizados.10 O valor de offset utilizado (nr = 500 Hz) foi determinado após a avaliação da supressão do sinal do eco ao se aplicarem valores entre 100 e 2000 Hz, e foi subtraído do sinal do tetrametilsilano (TMS), escolhido como referência. A representação esquemática destas sequências pode ser visualizada na Figura 1. A diferença entre as sequências SSS e USS é que na primeira as variações de Tr são aleatórias e na segunda essas variações são linear-mente espaçadas, ambos entre 0,3 e 1,3 ms. Para esses experimentos foram utilizados 40 valores de Tr, cujas variações foram efetuadas após a aplicação de 64 pulsos.Os espectros obtidos com estas sequências foram comparados com os obtidos com a sequência convencional, que consiste na aplicação de pulsos de 30o, espaçados por um Tp = 1,380 s (at = 0,9 s e Tr = 0,48 s).14 RESULTADOS E DISCUSSÃONa Figura 2 tem-se o sinal de RMN 13C no domínio do tempo, adquirido com a sequência SSFP, para a amostra de acetato de etila. Nela, pode-se ver claramente que o sinal é composto pelas compo-nentes FID e eco. A Figura 3 mostra a transformada de Fourier deste sinal, na qual se observa a presença das anomalias de fase, amplitude e batimentos laterais, devido à presença do eco no sinal no domínio do tempo.10 Já o espectro obtido com a sequência convencional (Figura 4) apresenta somente anomalias de amplitude, devido à utilização de um T2 ≈ Tp< 5T1.  Na Figura 5 tem-se o espectro de RMN 13C de acetato de etila obtido com a sequência de supressão SSS. Nesta figura, observa-se uma supressão significava das anomalias de fase e batimentos laterais, quando comparada com o espectro obtido com a sequência SSFP (Figura 3). No entanto, observou-se que a utilização de números aleatórios para efetuar as variações de Tr nem sempre leva a resultados satisfatórios e reprodutíveis, uma vez que a aplicação destes valores implica em uma dispersão não uniforme de Tr na faixa de tempo estabelecida. Este efeito pode ser minimizado com o aumento do número de variações; porém, isso leva a um aumento no tempo total de análise, fazendo com que esta sequência não apresente grande vantagem sobre a sequência convencional.A partir destes resultados, desenvolveu-se uma sequência tam-bém baseada na obtenção de espectros com diferentes valores de Tr, denominada USS. A diferença é que nesta sequência os passos são constantes e não mais aleatórios, permitindo uma distribuição uni-forme destes valores na faixa de tempo estabelecida e, consequente-mente, uma supressão eficiente e reprodutível das anomalias de fase e batimentos laterais. Na Figura 6, tem-se o espectro de RMN 13C Figura 1. Representação esquemática das sequências SSS e USS. Estas sequ-ências consistem na aplicação de um trem de pulsos de mesma fase, duração e intensidade, espaçados por um tempo Tp < T2. Neste trabalho, aplicou-se um trem de pulsos de 60° de mesma fase (x), e um tempo de aquisição (at) fixo de 299,7 ms. A variação do parâmetro Tp é realizada via variação de Tr, num intervalo de tempo que depende da frequencia de offset empregada, devendo ser igual a meio período de precessão dos spins nucleares estudados (equivalente à variação máxima de 180° na fase da componente eco), após a aplicação de 64 pulsos necessários para o estabelecimento do estado es-tacionário. Durante todo o experimento, efetuou-se o desacoplamento de 1HFigura 2. Sinal de RMN 13C no domínio do tempo de acetato de etila, obtido com a sequência SSFP, através da aplicação de pulsos de 60° de mesma fase, tempo de aquisição (at) de 299,7 ms e Tr igual a 0,3 msFigura 3. Espectro de RMN 13C de acetato de etila obtido com a sequência SSFP através da aplicação de um trem de pulsos de 60°, tempo de aquisição (at) de 299,7 ms e Tr igual a 0,3 ms. Na figura, os sinais foram ampliados para mostrar as severas anomalias de fase e batimentos laterais causados pela presença da componente eco no sinal no domínio do tempo (Figura 2) Figura 4. Espectro de RMN 13C de acetato de etila obtido com a sequência convencional, em que se aplicam pulsos de 30° espaçados por um Tp = 1,380 s (at = 0,9 s e Tr = 0,48 s). Como pode ser observado, esta sequência não gera anomalias de fase e batimentos laterais nos sinaisdos Santos et al.956 Quim. NovaFigura 5. Espectro de RMN 13C de acetato de etila obtido com a sequência SSS através da aplicação de um trem de pulsos de 60° de mesma fase (x), e um tempo de aquisição (at) fixo de 299,7 ms. Foram realizadas 40 variações aleatórias do parâmetro Tp (de 300 a 301 ms), através do parâmetro Tr , após a aplicação de 64 pulsos necessários para o estabelecimento do regime de estado estacionário. A faixa de variação de Tr (0,3 a 1,3 ms) foi definida pela frequência de offset utilizada (500 Hz). Nela, os sinais foram ampliados para evidenciar a supressão das anomalias de fase e batimentos lateraisFigura 6. Espectro de RMN 13C de acetato de etila obtido com a sequência USS através da aplicação de um trem de pulsos de 60° de mesma fase (x), e um tempo de aquisição (at) fixo de 299,7 ms. Foram realizadas 40 variações lineares do parâmetro Tp (de 300 a 301 ms), através do parâmetro Tr, após aplicação de 64 pulsos necessários para o estabelecimento do regime de estado estacionário. A faixa de variação de Tr  (0,3 a 1,3 ms) foi definida pela frequência de offset utilizada (500 Hz). Os sinais individuais foram ampliados para evidenciar a excelente supressão das anomalias de fase e batimentos laterais obtida, quando comparado com a supressão obtida com a sequência SSS (Figura 5)de acetato de etila obtido com a sequência USS, no qual se observa que além da supressão das anomalias de fase e batimentos laterais, tem-se também uma melhora na relação entre as intensidades relativas dos sinais, similares às observadas no espectro obtido com a técnica convencional (Figura 4).Esse método vem sendo aplicado a moléculas que apresentam um maior número de carbonos e os resultados obtidos confirmam a sua eficiência e reprodutibilidade na eliminação das anomalias de fase e batimentos laterais.CONCLUSÕESPelos resultados obtidos neste estudo, concluiu-se que a utilização de variações constantes para Tr permite uma dispersão mais uniforme destes valores na faixa de tempo estabelecida e, consequentemente, os resultados obtidos apresentaram uma supressão mais significativa das anomalias de fase e batimentos laterais do espectro de RMN 13C, além de uma maior reprodutibilidade dos resultados. AGRADECIMENTOSÀ Embrapa Instrumentação Agropecuária pela infraestrutura cedida. À FAPESP pelo auxílio concedido.REFERÊNCIAS 1. Carr, H. Y.; Phys. Rev. 1958, 112, 1693.  2. Azeredo, R. B. V.; Colnago, L. A.; Engelsberg, M.; Anal. Chem. 2000, 72, 2401. 3. Colnago, L. A.; Engelsberg, M.; Souza, A. A.; Barbosa, L. L.; Anal. Chem. 2007, 79, 1271. 4. Venâncio, T.; Engelsberg, M.; Azeredo, R. B. V.; Colnago, L. A.; J. Magn. Reson. 2006, 181, 29. 5. Azeredo, R. B. V.; Engelsberg, M.; Colnago, L. A.; Phys. Rev. E 2001, 64, 6309. 6. Ramadan, S. S.; Heyn, C.; · MacKenzie, L. T.; Chambers, A. F.; Rutt, B. K.; Foster, P. J.; Magn. Reson. Mater. Phy. 2008, 21, 251. 7. Klarhöfer, M.; Madörin, P.; Bilecen, D.; Scheffler, K.; J. Magn. Reson. Imaging 2008, 27, 1169. 8. Blume, U.; Lockie, T.; Stehning, C.; Sinclair, S.; Uribe, S.; Razavi, R.; Schaeffter, T. J. Magn. Reson. Imaging 2009, 29, 480. 9. Ernst, R. R.; Anderson, W. A.; Rev. Sci. Instrum. 1966, 37, 93. 10. Freeman, R.; Hill, H. D. W.; J. Magn. Reson. 1971, 4, 366. 11. Rudakov, T. N.; Beliakov, A. V.; J. Phys. D: Appl. Phys. 1998, 31, 1251. 12. Schwenk, A.; Prog. Nucl. Mag. Res.  Sp. 1985, 17, 69.  13. Schwenk, A.; J. Magn. Reson. 1971, 5, 376. 14. Braun, S.; Kalinowski, H. O.; Berger, S.; 150 and More Basic NMR Experiments: A Practical Course, 2nd ed, Wiley-VCH: New York, 1998.

Supressão das anomalias de fase e batimentos laterais em espectros de RMN 13C obtidos com a sequência de precessão livre no estado estacionário.

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