O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da heparina de sódio e do EDTA como anticoagulantes e o efeito destes fármacos sobre os parâmetros hematológicos de matrinxã (Brycon amazonicus)

ALMEIDA, F. F. L. de

BOIJINK, C. de L.

CHAGAS, E. C.

DAIRIKI, J. K.

SOUZA, F. C. de

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29      6.  HEPARI NA E EDTA COMO ANTICOAGULANTES PARA MATRI NXÃ (Brycon amazoni cus)  Franci el e Cri sti na de SOUZA1;  Edsandra Ca mpos  CHAGAS2;  Jony DAI RI KI2;  Fernanda Ferrei ra Lourei ra de ALMEI DA2; Cheil a de Li ma BOIJI NK2. .  1Centro Uni versitári o do Norte; 2Embrapa Amazôni a Oci dental   1. Introdução   A utili zação de di f erentes  anti coagul antes  na he matol ogi a clí ni ca e m pei xes  t em si do al vo de est udos  recentes ( Wal enci k & Wi teska 2007;  Ishi kawa et  al .,  2010a),  vi sto que exi stem peculi ari dades  que t ornam al guns  f ár macos  mai s  apropri ados  de acordo co m a espéci e,  assi m co mo observados  e m outros  vertebrados  ( Harr  et  al .,  2005). Para que se estabel eçam os  val ores  he mat ol ógi cos  de r ef erência,  t orna-se f unda mental  o conheci ment o do anti coagul ante mai s  apropri ado,  uma vez  que i númeras  al terações  i n vi tro rel aci onadas aos  anti coagul antes  t êm si do reportadas  e m pei xes  ( Hatti ngh 1975;  Mai nwari ng & Rowl ey 1985; Wal enci k & Wi teska 2007; Ishi kawa et al., 2010a).   Entre os  anti coagul antes e mpregados  para reali zar  os  procedi mentos  he mat ológi cos e m pei xes,  a hepari na e o EDTA são os  mai s  utili zados  ( Wal enci k & Wi teska 2007).  Entre as apresentações  destes  f ármacos,  t em-se pri nci pal mente a hepari na de sódi o,  hepari na de líti o,  EDTA di sódi co ( Na2EDTA),  EDTA di potássi co ( K2EDTA)  e o EDTA t ri potássico ( K3EDTA), que por  sua vez  at ua m em di f erentes  et apas  da cascata de coagul ação i ni bi ndo-a ( Harr  et al .,  2005),  dessa f or ma,  preserva-se a fl ui dez  do sangue que vi abili za a r eali zação do he mograma.   O matri nxã ( Brycon a mazoni cus)  é u ma das  pri nci pais  espéci es  nati vas  produzidas  no Brasil,  com i mportânci a econô mi ca rel evante,  especi al mente na r egi ão norte do Brasil. Est udos  sobre a fi si ol ogi a e parâmetros  he mat ol ógi cos  desta espéci e j á ve m sendo r eali zados (Tavares-Di as  et  al .,  2008)  e entre os  anti coagul antes,  a hepari na e o EDTA são e mpregados por diferentes pesqui sadores.  O obj eti vo deste est udo f oi  avali ar  a efi cáci a da hepari na de sódi o e do EDTA co mo anti coagul antes  e o ef ei to destes  f ár macos  sobre os parâmetros  he mat ol ógi cos  de matri nxã (Brycon amazoni cus).  2. Materi al e Métodos   Este est udo f oi  conduzi do no Laboratóri o de Pi scicultura da E mbrapa Amazôni a Oci dental.  Para i sso,  j uveni s de matri nxã f oram manti dos  e m t anques  ci rcul ares  de fi bra de vi dro co m capaci dade de 2000 L,  abasteci dos  com fl uxo contí nuo de água (1. 5 L  mi n- 1), durante o perí odo de um mês.   Nesse perí odo,  os  parâmetros de quali dade de água co mo t emperatura (29, 6 ± 0, 4 °C)  e oxi gêni o (5, 9 ± 0, 4 mg  L- 1)  f oram moni torados  três  vezes  por  se mana por  mei o de oxí metro di gi tal (YSI 55) e qui nzenal mente f oram avali ados  Foram utili zados  dez  i ndi ví duos  de matri nxã pesando 200 g.  Os  pei xes f oram capturados  co m auxíli o de puçá,  conti do mecani camente por  mei o de pano ú mi do e submeti dos  à venopunção caudal  (2, 5 mL)  utili zando seri ngas  est érei s co m vol ume  útil  de 3 mL  e  agul has  hi podér micas 25 x  7 mm i sentas  de anti coagul antes,  conf or me as preconi zações  de Ishi kawa et  al .  (2010a, b).  O sangue f oi  rapi damente di stribuí do e m i gual  vol ume de 0, 5 mL  e m quatro t ubos  de poli etil eno (1, 5 mL).  A pri mei ra alí quota f oi  acondi ci onada e m t ubo i sento de anti coagul ante (control e)  e nos  de mai s tubos  co m as segui ntes 30  concentrações  de anti coagul antes:  15 μL  de K3 EDTA 10 % ( 1 mg mL- 1  de sangue),  15 μL  de Hepari na 5. 000 UI  (150 UI   mL- 1  de sangue)  e 15 μL  de Hepari na 100 UI  (1,5 UI  mL- 1  de sangue), após dil ui ção a parti r da hepari na 5. 000 UI e m sol ução fi si ol ógi ca a 0,65 % (1:50).  Para deter mi nação da f ragili dade os móti ca dos  eri tróci tos  (FOE)  utili zou-se sol ução sali na tamponada (pH 7, 4)  conf or me descrito por  Parpart  et  al .  (1947).  As  dil ui ções  em séri e f oram feitas  a parti r  da sol ução estoque a 10, 5 %,  sendo utili zadas  as  segui ntes  concentrações: 0, 65 %,  0, 54 %,  0, 43 %,  0, 32 %,  0, 21 % e  0, 10 % de NaCl -PO4.  Os procedi ment os adotados para esta técni ca em pei xes f oram os modi ficados por Ishi kawa et al. (2010a).  A parti r  das  a mostras  sanguí neas  acondi ci onadas  co m os  anti coagul antes,  f oi  reali zada a dosage m do percentual  do he mat ócrito pel a t écni ca do mi crohe mat ócri to (Gol denf arb et  al .,  1971),  dosage m da t axa de he mogl obi na pel o mét odo da ci ano met ahe mogl obi na (Colli er,  1944)  e cont age m de eri tróci tos  utili zando a  dil ui ção de 1:200 e m sol ução de f ormol -citrato,  reali zando a contage m e m he moci tômetro.  De posse desses  dados,  f oram cal cul ados  os  í ndi ces  he mati métri cos  de Wi ntrobe (1934), compreendi dos  pel o Vol ume  Corpuscul ar  Médi o (VCM)  e Concentração de He mogl obi na Corpuscul ar  Médi a ( CHCM).  O sangue r emanescente f oi  estocado e m t e mperatura entre 5-7ºC,  por  um perí odo de 10 horas,  sendo avali ado após  esse perí odo vi sual ment e quant o à ocorrênci a de coagul ação e/ou hemóli se (Hatti ngh & Smi th 1976).   Os  r esul tados  f oram submeti dos  à análi se de vari ânci a e as  médi as  co mparadas  pel o teste de Tukey, a 5 % de probabili dade.  3. Resultados e Di scussão   A i ni bi ção da coagul ação sanguí nea e m matri nxã f oi  promovi da co m a  utili zação do K3 EDTA 10 %,  hepari na 5000 UI  e hepari na 100 UI  de f or ma efi ci ente e por  mais de 10 h sob refri geração.  No ent anto,  o K3 EDTA 10 % det er mi nou à ocorrênci a de di screta a moderada he móli se desde os  pri meiros  mo ment os,  observado nos  mi crotubos  capil ares  durant e a deter mi nação do he mat ócrito.  Adi ci onal mente,  f oi  observada i ntensa he móli se nas  a mostras acondi ci onadas com este anti coagul ante após 10h de ar mazena mento.  Os  r esul tados  dos  parâmetros he mat ol ógi cos de matri nxã utili zando o K3 EDTA e hepari na co mo anti coagul ant es  estão rel aci onados  na t abel a 1.  Pode-se observar  que o úni co parâmetro que f oi  i nfl uenci ado por  estes  f ár macos  f oi  o VCM,  i ndi cado pel o seu aument o (P < 0, 05) nas amostras acondi ci onadas com K3 EDTA 10 %.   Tabel a 1.  Parâmetros  hemat ol ógi cos  de  matri nxã (Brycon a mazoni cus)  utili zando  di f erentes anti coagul antes. Parâmetros Hepari na K3 EDTA   5. 000 UI 100 UI 10 % He mat ócrito ( %)  27, 6 ± 2, 87a 26, 9 ± 1, 72a 28, 9 ± 2, 55ª Eri trócitos (x 106 µL- 1) 1, 78 ± 0, 23a 1, 67 ± 0, 18a 1, 73 ± 0, 21ª He mogl obi na (g dL- 1) 8, 12 ± 0, 76a 8, 08 ± 0, 40a 8, 23 ± 0, 96ª VCM (fL) 155, 66 ± 8, 02a 158, 61 ± 8, 67a 167, 60 ± 7, 95b CHCM (g dL- 1) 29, 63 ± 3, 35a 30, 11 ± 1, 34a 28, 59 ± 3, 44ª Val ores  co m l etras  di f erentes e m u ma  mes ma  l i nha são  estati sti camente di ferentes  de acordo  co m o teste de Tukey (P<0, 05).   No t este de f ragili dade osmóti ca dos  eri tróci tos  (FOE)  f oi  verifi cado que o  K3 EDTA 10 % det er mi na a ocorrênci a de he móli se e m matri nxã,  vi sto que esta condi ção foi  observada desde a concentração de 0, 65 % de NaCl -PO4,  que é a concentração fi si ol ógi ca para pei xes. Al ém di sso,  este anti coagul ante aumentou a sensibili dade dos  eri tróci tos  à he móli se nas concentrações  0, 54 % e  0,43 % de NaCl -PO4  (P < 0, 01).  Por  outro l ado,  a hepari na 5. 000 UI e 100 UI  não i nfl uenci aram na  sensi bili dade dos  eritróci tos  de matri nxã frente ao estresse os móti co (Fi gura 2).  31   Fi gura 1.  Fragili dade  os móti ca  dos  eri trócitos  e m matri nxã  ( Brycon a mazoni cus)  utili zando di f erentes anti coagul antes.  Letras  di ferentes  e m mes ma  concentração de  NaCl -PO4  ( %)  i ndi cam di f erença estatí sti ca entre os anti coagul antes, de acordo com o teste de Tukey (P < 0, 01).   Neste est udo,  o EDTA tri potássi co 10 % e  as  duas  concentrações  de hepari na de sódi o avali adas  f oram efi cazes  na prevenção da coagul ação sanguí nea por  mai s  de 10 h e m matri nxã,  sendo este t empo adequado para a r eali zação do exa me he mat ol ógico.  Por  outro l ado,  e m surubi m hí bri do (Pseudopl atystoma reti culat um x  P.  corruscans)  a hepari na 100 UI não f oi  efi ci ente para preservação do sangue por  mai s  de 10 h,  ocorrendo coagul ação das a mostras  (Ishi kawa et  al . 2010).  Hepari na nas  concentrações  aci ma de 100 UI  mL- 1  e Na2 EDTA nas  concentrações  aci ma de 4 mg mL- 1  f oram efi ci entes  na i ni bi ção da coagul ação e m Bl enni us pholi s ( Mai nwaring e Rowl ey 1985).  Bai xas  concentrações  de hepari na e  EDTA deter mi naram a  ocorrência de coagul ação parci al  e ou t otal  e m carpa co mum,  Cypri nus carpi o (Smi t  et  al .  1977),  be m co mo e m B.  pholi s ( Mai nwari ng e Rowl ey 1985). Dessa f or ma, pode-se observar  peculi ari dades  rel aci onas  à espéci e,  corroborando o f ato de que os anti coagul antes deve m ser avali ados para cada espéci e em parti cul ar.  He móli se e m a mostras  acondi ci onadas  co m EDTA foi  reportada nos  pei xes  Labeo umbratus,  L.  capensi s,  Barbus  hol ubi  e  Cl ari as  gari epi nus  ( Hatti ngh 1975), carpa co mu m (Hatti ngh 1975;  Smi t  et  al.  1977;  Wal enci k e Wi teska 2007),  surubi m hí bri do (Ishi kawa et al .  2010a)  e matri nxã no presente est udo,  al ém de outros  vertebrados  co mo réptei s e aves (Hatti ngh e Smi t  1976). Este anti coagul ante promove a quel ação dos  í ons  Ca2 +  que deter mi na di stúrbi os  na per meabili dade e estabili dade da me mbrana dos  eri tróci tos ( Wal enci k e Wi teska 2007),  dessa f or ma,  os  eri trócitos  t ornam-se sensí vei s a vari ações  e m seu vol ume por  f al has  nas  trocas  i ôni cas  reali zadas  e m sua me mbrana,  o que j ustifi ca o aument o do VCM em matrinxã deste estudo.   No t este de f ragili dade osmóti ca dos  eri tróci tos,  os  di stúrbi os  na per meabili dade que aco met eu os  eri trócitos  cuj o sangue f oi  acondi cionado co m K3 EDTA mostrou-se mai s evi dente,  reproduzi ndo grande i ncrement o no percentual  de he móli se. Esta si tuação corrobora os  resul tados  descritos  e m carpa co mu m ( Wal enci k e Wi teska 2007)  e  surubi m hí bri do (Ishi kawa et  al .  2010a),  be m co mo observado t ambé m e m hu manos  ( Kaf ka e Yer mi ahu 1998).  Al ém disso,  essa condi ção possui  ef ei to dose-dependente,  onde al tas concentrações  de EDTA apresentam val ores  superi ores  no percentual  de he mól ise ( Wal enci k e Wi teska 2007;  Maf uvadze e Erl wanger  2007;  Ishi kawa et  al .  2010a).  Por  outro l ado,  a hepari na pura e ou dil uí da co mo anti coagul antes  não i nfl uenci aram a  f ragili dade os móti ca dos  eri trócitos,  apresentando r esul tados  si mil ares ao gr upo se m anti coagul ante.  Ef ei to semel hante f oi  observado e m surubi m hí bri do quando utili zado a hepari na 100 UI,  o que f az deste anti coagul ante i deal  para reali zação do t este de f ragili dade os móti ca dos  eri tróci tos  e m pei xes (Ishi kawa et al. 2010a) e no home m (Kaf ka e Yer mi ahu 1998).  A utili zação da hepari na,  citrato de sódi o e  Na2 EDTA não ocasi onaram al terações  nos parâmetros  he mat ol ógi cos bási cos  de carpa co mu m ( Wal enci k e Wi teska 2007)  e  surubi m hí bri do (Ishi kawa et  al .  2010a).  Nas  aves  Struthi o ca mel us  ( Maf uvadze e Erl wanger  2007)  e Amazona ventrali s ( Guz man et  al .  2008)  f oi  descrito val ores  superi ores  de he mat ócri to quando utili zado o EDTA t ri potássi co e di potássi co,  respecti vamente,  e m r el ação à hepari na de l í ti o.  Nestas  condi ções,  o aument o do percentual  do he mat ócrito deve-se ao au ment o concomi tante do VCM,  no ent anto,  neste est udo co m o matri nxã f oi  observado o au ment o do VCM se m al terações  si gnificati vas  no he mat ócrito (P > 0, 05),  o que pode ser  justifi cado pel a he móli se verifi cada desde os pri mei ros mo ment os.   Co m base nos  resul tados  do est udo é possí vel  conclui r  que a  utili zação da hepari na como anti coagul ante é mai s apropri ada para matrinxã ( Brycon a mazoni cus), vi sto que f oi  efi ci ente na prevenção da coagul ação por  mai s  de 10 h,  se m ocasi onar he mól i se,  ou al terações  nos  parâmetros  he mat ol ógi cos  e na fragili dade os móti ca dos eri tróci tos.  A hepari na 100 UI  t orna-se mai s  econô mi ca e não apresenta di f erença práti ca e m r el ação à hepari na 5. 000 UI, sendo ent ão o anti coagul ante de el ei ção para o matri nxã.  32   4. Ref erênci as   Ishi kawa,  M. M.;  Pádua,  S. B.;  Sat ake,  F.;  Pi etro, P. S. ;  Hi sano,  H. 2010.   Procedi ment os bási cos  para col hei ta de sangue e m pei xes.  Ci rcular  Técni ca,  17.  Embrapa Agropecuári a Oeste, 8.  Tavares-Di as,  M. ;  Ol i vei ra,  S. R. 2009.  A r evi ew of  t he bl ood coagul ati on system of  fi sh. Revi sta Brasil ei ra de Bi oci ênci as. 7(2): 205-224.   Tavares-Di as,  M.  et  al . 2008.  Co mparati ve st udy on he mat ol ogi cal  parameters  of  f ar med matri nxã,  Brycon a mazoni cus  Spi x and Agassi z,  1829 ( Characi dae:  Bryconi nae)  wi th ot hers Bryconi nae speci es. Acta Amazôni ca, 38: 799-806.  Tavares-Di as,  M. ;  SANDRIM,  E. F. S. 1998.  I nfl uence of  anti coagul ants  and bl ood st orage on he mat ol ogi cal  val ues  i n ta mbaqui ,  Col ossoma macropo mu m.  Acta Sci enti arum:  bi ol ogi cal sci ence, 20(2): 151-155.   Wal enci k,  J.;  Wi teska,  M. 2007.  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Heparina e EDTA como anticoagulantes para matrinxã (Brycon amazonicus).

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Heparina e EDTA como anticoagulantes para matrinxã (Brycon amazonicus).

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