BORGES, C. D.

SALTON, J. C.

SOUZA, D. G. de

TAKEZAWA, D. O.

TOMAZI, M.

TSAI, S. M.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

  1 Bactérias indicadoras da emissão de N2O em solo de pastagens afetado por urina de bovinos   Clovis Daniel Borges(1); Michely Tomazi(2); Dennis Goss de Souza(1); Daniela Oliveira Takezawa(3); Júlio César Salton(2); Siu Mui Tsai(4) (1)Pós-Graduando em Ecologia Aplicada, pela Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”e Centro de Energia Nuclear na Agricultura (ESALq-CENA, USP), Piracicaba, São Paulo. clovisdb@usp.br. (2)Pesquisador(a), Embrapa Agropecuária Oeste, Dourados, MS. (3)Granduanda em Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul e estagiária na Embrapa Agropecuária Oeste; Dourados, MS. (4)Professora Titular, Universidade de São Paulo (USP), Piracicaba, São Paulo. tsai@cena.usp.br.     RESUMO: Medidas diretas da redução de N2O no campo e suas relações com a comunidade microbiana são escassas. O conhecimento mais atual das associações de emissão com a comunidade microbiana tem sido inferido a partir de condições controladas. Neste estudo avaliou-se as associações das emissões de N2O com a comunidade desnitrificante do solo a campo em dois sistemas de produção, ILP e PP. A amostragem do solo foi realizada na estação experimental da Embrapa Agropecuária Oeste, em Dourados em dois sistemas de produção, integração lavoura-pecuária (ILP) com sucessão soja/aveia e pastagem permanente (PP), com aplicação de doses crescentes de urina (0 L-controle; 0,8 L, 1,5 L e 2,2 L). Os fluxos de N2O foram determinados por cromatografia gasosa e o número de cópias dos genes cnorBB e nosZ avaliado por PCR em tempo real (qPCR). A emissão de N2O foi maior na ILP do que na PP, tanto no solo controle (21x) como nas doses de urina (5 a 16x). As concentrações de NO3- no solo foram maiores na ILP porém a relação NO3-/N2O foi menor. O número de cópias de bactéria total por grama de solo seco foi de quase 2 vezes maior em PP que ILP. A mesma tendência foi observada para o gene cnorBB, enquanto que maior abundância da comunidade de nosZ responsável pela transferência de N2O para N2 foi observada na ILP. As emissões de N2O são influenciadas tanto pela comunidade microbiana como pela quantidade de substrato disponível, os quais dependem do sistema de manejo do solo.  Termos de indexação: ecologia microbiana, desnitrificação, gases de efeito estufa.  INTRODUÇÃO  O aumento da concentração do gás óxido nitroso (N2O) na atmosfera tem recebido especial atenção em função do seu potencial de aquecimento global, aproximadamente 300 vezes maior que o CO2. No Brasil, as atividades agrícolas contribuem com aproximadamente 80% das emissões de N2O, sendo que 50% destas emissões são referentes à criação de animais em pastagem (MCT, 2013). A produção de N2O no solo é mediada pela dinâmica do N no sistema, a qual está diretamente relacionada às condições climáticas e às práticas de manejo do sistema de produção que afetam as condições do solo (Piva et al., 2012). Sistemas de produção com alternância entre lavoura e pecuária tem sido apontados como promissores para ambas as atividades, resultando em melhorias da qualidade do solo quando comparados a sistemas exclusivamente com pastagem (Salton et al., 2012). A urina depositada durante o pastejo representa uma importante fonte de N disponível para as reações microbianas (Luo et al., 2010), podendo aumentar as emissões de N2O do solo. A produção de N2O no solo está associada principalmente ao processo de desnitrificação, resultado da respiração microbiana dentro do ciclo do N, responsável em retornar o N fixado para biosfera. Este processo é favorecido sob altas condições de umidade, onde o oxigênio é limitado, e o NO3- e o carbono orgânico estão disponíveis (Luo et al., 2010). Apesar dos solos sob pastagem apresentarem em geral boa drenagem, podem ocorrer micro-sítios no interior de agregados com baixa disponibilidade de oxigênio, condições favoráveis à desnitrificação (Carter, 2007;).  Desta forma, o sistema de produção pode influenciar diretamente o potencial do solo para emissão de N2O, tanto antes como após adição de N, como na forma de urina dos animais. Surpreendentemente, pouco se sabe sobre os possíveis reguladores e redutores de N2O por enzimas associadas à desnitrificação. Estas enzimas têm sido usualmente estudadas pela abundância dos genes cnorBB e nosZ (Mergel et al., 2001). Ademais, a comunidade microbiana do solo é capaz de regular as emissões de N2O naturalmente, podendo atuar como fonte ou dreno de N2O (Morales et al., 2010). Contudo, não há registro de estudos com avaliação da abundância da comunidade desnitrificante em solo afetado por urina em pastagens conduzidas em integração lavoura-pecuária (ILP) e pastagem permanente (PP). O objetivo deste estudo foi avaliar as associações das emissões de N2O com a comunidade desnitrificante do solo a campo em dois sistemas de produção, ILP e PP.    2  MATERIAL E MÉTODOS  O estudo foi conduzido na área experimental da Embrapa Agropecuária Oeste, em Dourados, Mato Grosso do Sul (22°16'56,08'' S and 54°48'17,17'' W). O solo é Latossolo Vermelho, com 630 g kg-1 de argila, e o clima classificado como Cwa (köppen) com verão quente e inverno seco. O experimento foi instalado em duas áreas de pastagem, sendo uma em sistema de integração lavoura-pecuária (ILP) e outra com pastagem permanente (PP), ambas pertencentes a um experimento de longa duração implantado em 1995. A área de ILP é alternada a cada 2 anos com pastagem de braquiária decumbens (Urochloa decumbens syn. Brachiaria decumbens Stapf) e a rotação soja/aveia em plantio direto. Na PP é utilizada a mesma gramínea, porém não recebe correção do solo nem fertilização desde sua implantação.  Três meses antes da instalação do experimento uma área de 50 x 30 m foi isolada em cada pastagem, para evitar interferência de fezes e urina previamente. A área da ILP encontrava-se no início da fase de pastejo, com a pastagem vigorosa devido influência da lavoura, enquanto que a PP estava bastante debilitada em função da forte geada no ano anterior. Nos dois sistemas de manejo (ILP e PP) aplicou-se três doses crescentes de urina (0,8L, 1,5L e 2,2L) e, uma parcela foi deixada sem aplicação para controle, seguindo o delineamento em blocos casualizados com três repetições.   A urina foi coletada de vacas leiteiras alimentadas com mesmo tipo de forragem, sem suplementação no cocho, armazenada à ± 4ºC por no máximo cinco dias.  As doses de urina foram aplicadas sob a pastagem na parte interna de bases metálicas (0,36 x 0,56 cm) previamente fixadas no solo, simulando as excreções dos animais. Simultaneamente, numa área adjacente, com mesmo delineamento experimental, foram aplicados os mesmos tratamentos em áreas de 1,5 x 2 m, em quantidades equivalentes a área da base para avaliação das variáveis de solo.  A amostragem de ar para avaliação das emissões de N2O foi realizada pelo método da câmara estática com procedimentos descritos por Parkin e Venterea (2010), adaptando-se câmaras com 36,5 x 56,5 cm e 32 cm altura, confeccionadas com caixas de polipropileno e revestimento de manta térmica aluminizada. Foram coletados três seringas de cada câmara, nos tempos 0, 15 e 30 minutos e a concentração de N2O determinada por cromatografia gasosa. Os fluxos de N2O do solo foram calculados pelo aumento da concentração do gás no interior da câmara na unidade de tempo. O DNA foi extraído de amostras de solo congeladas, usando PowerSoil lizer DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA). Os genes funcionais que codificam 16S rRNA, cnorBB e nosZ foram quantificados pela técnica de PCR em tempo real (qPCR), utilizando StepOne Plus real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, USA). Foi construída uma curva padrão para quantificação do número de cópias do gene usando uma diluição seriada 108 a 102 de um fragmento conhecido de DNA sequenciado por M13 PCR de clones gerados durante este estudo. a correlação linear entre a diluição e o número de cópias do gene (R≥0,99) mostrou que não houve interferência dos inibidores de PCR na quantificação do gene.  RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste estudo são apresentados os resultados do 9º dia após aplicação da urina, quando foi observado aumento nas emissões de N2O (Figura 01). Os fluxos de emissão de N2O aumentaram com o aumento da dose aplicada, em ambas as pastagens. Para o solo com urina, a emissão na ILP foi de 5 a 16 vezes maior que na PP (Figura 1A), enquanto que no solo controle a diferença foi de 21 vezes. Dentre as variáveis que podem influenciar a emissão de N2O estão a porosidade preenchida por água, o carbono prontamente disponível, a temperatura do solo, a quantidade de N mineral disponível (Carter, 2007) e a especificidade da comunidade microbiana (Richardson, 2012). A temperatura do solo e a porosidade preenchida por água não diferiram entre os tratamentos (dados não apresentados), portanto não foram considerados como fonte de variação. Os maiores teores de NO3- disponível no solo na ILP (Figura 1B) foram determinantes para os maiores fluxos de N2O. Este comportamento foi observado também no solo controle, o que deve-se a influencia do sistema de produção na dinâmica do N mineral do solo. A pastagem da ILP havia sido implantada logo após a rotação com lavoura e provavelmente disponibilizava de N residual da cultura da soja, por outro lado, a PP não recebia N desde sua implantação. Desta forma, a aplicação de urina na ILP resultou em maiores concentrações de NO3- disponível no solo visto que necessitava menor entrada de N no sistema para suprir as exigências da gramínea. Por outro lado, na PP a demanda do sistema por N era maior, de forma que maior parte do N pode ter sido imobilizado pela absorção da planta ou utilização pela comunidade microbiana. Somente na PP foi possível observar visualmente   3 variação no desenvolvimento e coloração da gramínea, principalmente na maior dose. Entretanto, apesar da maior concentração de NO3- na ILP, a taxa de conversão de NO3- em N2O foi menor, como pode ser verificado na relação NO3-/N2O (Figura 1C). Vários estudos apontam a desnitrificação como principal fonte de produção de N2O (Luo et al., 2010; Carter, 2007), no entanto, a emissão de N2O do solo depende também da atividade das bactérias envolvidas no processo de transformação do N no solo.  A comunidade total de bactérias resultou em menores densidades do gene na ILP (Figura1E) e similarmente a comunidade desnitrificante cnorBB, responsável pela transferência de NO para N2O foi menor na ILP (Figura 1D), o que explica a menor taxa de conversão do NO3- em N2O comparado a PP. Adicionalmente, foi observado maior abundância da comunidade de nosZ responsável pela transferência de N2O para N2 na ILP que na PP (Figura 1F). Caso a comunidade de nosZ fosse menor, a emissão de N2O na ILP poderia ser aumentado. Portanto, pode-se inferir que a funcionalidade da comunidade microbiana variou em função do sistema de manejo e influenciou na emissão de N2O do solo. Em uma relação global dos possíveis fatores que podem regular as emissões de N2O observou-se que a concentração de NO3- no solo resultou em uma correlação de R2= 0.99**. Outros fatores podem ser menos impactantes, mas não deixando de ser significativos reguladores dos fluxos de N2O (Figura2).  Todas estas hipóteses levantadas precisam ser ainda melhor elucidadas, repetindo o experimento outros períodos durante a fase de pastagem da ILP, pois ao longo do pastejo é esperado uma redução no N do solo, o que pode influenciar nas emissões entre outro fatores. Apesar da menor emissão de N2O na área com PP é necessário avaliar com cautela este resultado, visto que este sistema apresentou na comunidade microbiana um maior potencial para emissão de N2O. Além disso, para avaliação da qualidade do sistema de manejo é importante a quantificação das demais fontes de emissão de gases de efeito estufa.  CONCLUSÕES Medidas diretas da emissão de N2O do solo a campo e suas associações com a comunidade microbiana mostraram conexões da produção de N2O e os genes associados as enzimas desnitrificantes. A disponibilidade de NO3- foi determinante na emissão de N2O pelo solo. Os genes 16S rRNA, cnorBB e nosZ foram afetados pelos diferentes sistemas de produção e doses de urina aplicada.   AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPESP (2008/58114-3) e ao CNPq (564936/2010-3; 485801/2011-6; 304713/2010-4, 143307/2011-8) pelo apoio financeiro e a equipe da Embrapa Agropecuária Oeste pela condução do experimento a campo.  REFERÊNCIAS CARTER, M. S. Contribution of nitrification and denitrification to N2O emissions from urine patches. Soil Biology & Biochemistry. 39:2091-2102, 2007. Ministério da Ciência e Tecnologia, 2013. Relatórios de Referência: Emissões de Óxido Nitroso de Solos Agrícolas e Manejo de Dejetos. Disponível em: http://www.mct.gov.br/index.php/content/view/310922.html. Acesso em 13/04/2013.  SALTON, J. C.; ZANATTA, J. A.; TOMAZI, M. ; SILVA, W. M. Soil organic matter in crop-livestock systems after 16 years on Midwest Brazil. In: II International Symposium on Integrated Crop-Livestock Systems, 2012, Porto Alegre. Anais do II ISICLS. Porto Alegre: INRA/UFPR/UFRGS/USDA, 2012 LUO J, DE KLEIN CAM, LEDGARD SF, SAGGAR S. Management options to reduce nitrous oxide from intensively grazed pasture: a review. Agriculture, Ecosystems & Environment. 136:282-291, 2010. MERGEL, A.; KLOOS, K.; BOTHE, H. Seasonal fluctuations in the population of  denitrifying and N2 -fixing bacteria in an acid soil of a Nor way spruce forest. Plant and Soil, 230:145-160, 2001. PARKIN, T.B.; VENTEREA, R.T. Sampling Protocols. Chapter 3. Chamber-Based Trace Gas Flux Measurements. IN Sampling Protocols. R.F.Follet, editor. p. 3-1 to 3-19. Disponível: www.ars.usda.gov/research/GRACEnet.  PIVA, J. T. ; DIECKOW, J. ; BAYER, C. ; ZANATTA, J. A. ; MORAES, A. ; PAULETTI, V. ; TOMAZI, M. ; PERGHER, M. No-till reduces global warming potential in a subtropical Ferralsol. Plant and Soil,  45: 1-15, 2012. RICHARDSON, D; FELGATE, H; WATMOUGH, N; THOMSON, A; BAGGS, E. Mitigating release of the potent greenhouse gas N2O from the nitrogen cycle–could enzymic regulation hold the key? Trends in Biotecnology, 27;388-397, 2009.    4       Figura 1. Fluxo de de N2O (A), teores de NO   (B), relação NO   / N2O (C), determinação dos genes 16S rRNA (D), ccnorBBB (E), nosZ (F) após 10 dias da instalação do experimento. A aplicação das doses de urina foram distribuidas da seguinte forma T= sem urina, U1= 0.8L, U2= 1.5L, U2= 2.2L corresponde a um animal aldulto em dois sistemas de manejo do solo. ILP= integração lavoura-pecuária e PP= pastagem permanente.  Figura 2. Representação das network das variáveis microbiológicas e biogeoquímicas. Somente as correlações com p<0,05 foram usadas para construção da network. (A) (D) (C) (B) (E) (F) 

Bactérias indicadoras da emissão de N2O em solo de pastagens afetado por urina de bovinos.

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