DALLA COSTA, O. A.

FEDDERN, V.

GRESSLER, V.

LAUX, A. R.

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   69  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC UTILIZAÇÃO DE SPE-LC-MS/MS PARA DETERMINAÇÃO DE RACTOPAMINA EM URINA DE SUÍNOS  Angélica Riqueli Laux1; Vivian Feddern2; Osmar Antonio Dalla Costa2  e  Vanessa Gressler3 1Graduanda em Nutrição pela Universidade do Contestado, Campus Concórdia,  estagiária da Embrapa Suínos e Aves, e-mail: angelica.laux@hotmail.com 2Pesquisador(a) da Embrapa Suínos e Aves 3Analista da Embrapa Suínos e Aves  Palavras-chave: extração em fase sólida, cromatografia líquida, espectrometria de massas, resíduo de ractopamina, urina.  INTRODUÇÃO A ractopamina é um agonista ß-adrenérgico de uso controlado em muitos países, incluindo o Brasil. Este aditivo é adicionado em rações para promover o aumento da deposição de carne e a redução do total de gordura na carcaça (1,2). No Brasil, o MAPA permite a utilização exclusiva da ractopamina em rações para suínos em fase de terminação em doses de 5-20 mg/kg (1) e segundo a FAO (2), os limites máximos permitidos de resíduos de ractopamina em suínos são de 10 µg/kg para músculo, 40 µg/kg para fígado, 90 µg/kg para rim e 90 µg/L para urina. Uma vez que esta substância possui restrições no mercado, é de extrema importância seu monitoramento. Sendo assim, torna-se necessário o desenvolvimento e implantação de metodologias de detecção desta substância para assegurar que os produtos destinados ao consumidor sejam seguros, ou seja, dentro das especificações impostas pelos órgãos regulamentadores. Desta forma, o presente trabalho visa implantar uma metodologia otimizada para análise de resíduos de ractopamina em urina de suínos por extração em fase sólida (SPE) e determinação por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS).  MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de 5 mL de urina branco (sem resíduo de ractopamina) foram pipetados em tubos tipo Falcon de 15 mL, fortificadas (spike) e agitadas em vortex por 1 min. Na sequencia, as amostras foram hidrolisadas com aproximadamente 5.000 IU de enzima -glicuronidase por 2 h a 65 ºC (3). Após os pHs das amostras foram ajustados para 6-7, seguido de centrifugação (5.000 g, por 10 min). A extração em fase sólida foi realizada utilizando cartucho SupelMIP (25 mg/10 mL, Supelco) da seguinte forma: condicionamento com 1 mL de metanol, 1 mL de água Milli-Q e 1 mL de acetato de amônio 25 mM (pH 6,7); aplicação da amostra seguido de 2 min de vácuo; lavagem do cartucho com 1 mL de água Milli-Q, vácuo por 2 min, 1 mL de acetonitrila com 1% de ácido acético, 1 mL acetato de amônio 50 mM (pH 6,7), 1 mL da solução d 60% acetonitrila/40% água Milli-Q e vácuo por 2 min; eluição com 2 x de 1 mL de metanol com 10% de ácido acético (4). As amostras foram secas em N2(g), ressuspendidas em 1 mL de metanol/água 1:1 e injetadas no LC-MS/MS. Os experimentos foram realizados em triplicata. O sistema de análise utilizado consistiu em um cromatógrafo líquido Surveyor Plus acoplado a um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo TSQ Quantum Access Max ambos da Thermo Scientific. A separação cromatográfica foi realizada em coluna ACE 5 C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) equipada com coluna guarda C18 e equilibrada a 30 ºC. O volume de injeção da amostra foi de 10 µL. O gradiente de eluição utilizado consistiu de duas fases (eluente A, água Milli-Q com 0,1% de ácido fórmico e eluente B, metanol com 0,1% de ácido fórmico) com o seguinte sistema de eluição: 0-0,5 min isocrático 65% A e 35% B; 0,5-2,5 min gradiente até 100% de B; 2,5-5,0 min isocrático 100% B; 5,0-5,5 min gradiente até 65% A e 35% B; 5,5 – 10 min isocrático 65% A e 35% B, em um fluxo de 1,0 mL/min. A detecção foi realizada por electrospray com ionização no modo positivo. O espectrômetro de massas operou nas seguintes condições: voltagem do spray de 4.500 V, temperatura de vaporização de 300 ºC, pressão de bainha de gás de 45 psi, pressão de gás auxiliar de 20 psi, temperatura do capilar de 305 ºC e pressão do gás de colisão (argônio) de 1,7 mTorr. O modo de quantificação para os resíduos de ractopamina utilizado foi o Selected Reaction Monitoring (SRM). O íon precursor monitorado foi o m/z 302,2 e os íons filhos m/z 284,3, m/z 164,2 e m/z 107,2 com as respectivas energias de colisão: 9 V, 12 V e 30 V.           70  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC RESULTADOS E DISCUSSÕES A Tabela 1 apresenta os resultados de recuperação de amostras de urina dopadas (Spike) com ractopamina em diversas concentrações usando LC-MS/MS.  Outros parâmetros de validação também foram verificados, como os limites de detecção (LOD), de quantificação (LOQ) e linearidade. Os LOD e LOQ foram determinados pelo método visual, sendo que o LOD foi expresso através do estabelecimento do nível mínimo ao qual a substância pode ser detectada com segurança e o LOQ três vezes o LOD. Os limites encontrados foram de 0,01 ng/mL para LOD e 0,03 ng/mL para LOQ. A linearidade do método foi obtida da curva de calibração com treze pontos no intervalo de 0 a 250 ng/mL (R2 = 0,9932).  CONCLUSÕES O método aplicado para análise de ractopamina em urina mostrou-se bastante eficiente, com taxas de recuperação superiores a 70% e com limites de detecção e quantificação extremamente baixos, possibilitando a identificação e quantificação de resíduos abaixo do limite estabelecido pela FAO (2) que é de 90 ng/mL. Além disso, o método mostrou-se relativamente rápido, com um preparo de amostras de aproximadamente 6 horas, tornando-o viável para implantação em laboratórios de análises de rotina.  AGRADECIMENTOS FAPESC – Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina.  REFERÊNCIAS 1. MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - Antimicrobianos anticoccidianos e agonistas autorizados DFIP - dezembro 2008. Disponível em <http://www.agricultura.gov.br/ portal/page/portal/Internet-MAPA/pagina-inicial/animal/alimentacao> Acesso em: 03 fev. 2011. 2. FAO. UN food safety body sets limits on veterinary growth promoting drug. Codex Alimentarius Commission adopts maximum residue levels. 06 jul. 2012. Disponível em: <http://www.fao.org/news/story/en/item/150953/icode/>. Acesso em: 25 jul. 2012. 3. KOOTSTRA, P. R.; KUIJPERS, C. J. P. F.; WUBS, K. L.; VAN DOORN, D.; STERK, S. S.; VAN GINKEL, L. A.; STEPHANY, R. W. The analysis of beta-agonists in bovine muscle using molecular imprinted polymers with ion trap LCMS screening. Analytica Chimica Acta, v. 529, p. 75-81, 2005. 4. HEEMKEN, O.; WHILBORG, A.-K. Comparison of SupelMIPTM SPE – Beta-agonists and Mixed-mode SPE for the extraction of beta-agonists from urine samples. Supelco Analytical Report. v. 26.4, p. 13-15, 2008. Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Supelco/The_Reporter/t208004.pdf. Acesso em: 04 set. 2013    Tabela 1. Recuperação de ractopamina de amostras de urina contaminadas utilizando LC-MS/MS. Spike (ng/g) Recuperação (%) 10 70,19  50 74,36  100 78,71  150 72,79                

Utilização de SPE-LC-MS/MS para determinação de ractopamina em urina de suínos.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/973847/1/final7283.pdf

Utilização de SPE-LC-MS/MS para determinação de ractopamina em urina de suínos.

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