ANDRIOLI, A.

BRITO, R. L. L. de

OLIVEIRA, E. L.

PINHEIRO, R. R.

RODRIGUES, A. de S.

SIDER, L. H.

SOUZA, K. C. de

VERAS, A. K. A.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

XII Encontro de Iniciação Científica2010Avaliação do RT-nested PCR como método de diagnóstico da artrite-encefalite caprina em cabritos comsintomatólogia nervosaAna Kamila Andrade Veras(1) - Roberta Lomonte Lemos de Brito(2) - Apoliana de Sousa Rodrigues(3) - Kelma Costa de Souza(4) -Eduardo Luís Oliveira(5) - Alice Andrioli(6) - Lucia Helena Sider(7) - Raymundo Rizaldo Pinheiro (8) - 1. Universidade Estadual Vale do Acaraú/Bolsista Embrapa - 2. Embrapa Caprinos e Ovinos/CNPq - 3. Embrapa Caprinos e Ovinos/CNPq - 4.Embrapa Caprinos e Ovinos/CNPq - 5. Embrapa Caprinos e Ovinos - 6. Embrapa Caprinos e Ovinos - 7. Embrapa Caprinos e Ovinos - 8. EmbrapaCprino e Ovinos  - PALAVRAS-CHAVECAE, vírus, forma nervosa, líquor, RT-nested PCR, cabritosAPOIOEmbrapa INTRODUÇÃOA artrite encefalite caprina (CAE) é uma doença viral crônica, multissistêmica e de natureza debilitante. O controle e erradicação são  difíceis devido àausência de vacinas eficazes e à detecção geralmente tardia de animais positivos. Dentre os sintomas, a forma nervosa é rara e geralmente afetacabritos com idades entre 60-120 dias (PUGH, 2002). A avaliação clínica não é suficiente para determinar a doença, uma vez que as principaismanifestações podem ser confundidas com outras doenças. O diagnóstico final deve ser realizado por técnicas sorológicas e moleculares. Osmétodos sorológicos já estão bastante difundidos devido a sua maior conveniência. No entanto, devido à sua natureza indireta, eles só detectamanticorpos após a soroconversão, tornando necessário o uso de técnicas moleculares capazes de identificar ácidos nucleicos virais de maneira maisprecoce. Além disso, os métodos moleculares permitem analisar vários tipos de amostras, não ficando limitados à amostra sorológica.OBJETIVOSAvaliar a técnica de reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa com duas rodadas sucessivas de amplificação (RT-nestedPCR) para a detecção de RNA genômico livre em amostras de sangue e líquido céfalorraquidiano provenientes de sete cabritos com sintomatologianervosa e sorologicamente positivos para a artrite-encefalite caprina de acordo com o teste western blot.MATERIAL E MÉTODOSO trabalho foi conduzido em novembro de 2008 na Embrapa Caprinos e Ovinos. De uma população de 71 cabritos, com idades entre 87 e 103 dias, 7apresentaram sintomas neurológicos compatíveis com a CAE. Após a conclusão da avaliação clínica, os cabritos foram submetidas à coleta desangue por punção da veia jugular utilizando tubos vacutainer, com EDTA. Os leucócitos foram isolados e o RNA extraído com o sistemaNucleoSpin-RNA II (Macherey Nagel). O RNA foi então convertido a cDNA com o ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega). O cDNApassou por duas rodadas de amplificação do gene estrutural gag com primers externos (BARLOUGH; EAST; ROWE et al., 1994) e internos(ANDRIOLI, 2001). O líquido cefalorraquidiano (LCR) foi coletado de acordo com PUGH (2002). Alíquotas foram centrifugadas a 12.000g a 4°C por30 minutos para sedimentar as partículas virais livres. Os péletes resultantes foram submetidas a processos de extração de RNA, seguidos deRT-nested PCR, como descrito acima.RESULTADOS E DISCUSSÃODe uma população de 71 cabritos, sete apresentaram sintomas neurológicos e aumento de freqüência cardíaca, sendo cinco machos (Ma1-5) e duasfêmeas (Fe1-2). O diagnóstico precoce é indispensável para a prevenção e controle eficazes da infecção pelo vírus da CAE e não deve ser baseadosomente em sinais clínicos, uma vez que eles não são específicos para esta doença. A detecção de anticorpos e/ou partículas virais são indicadospara o diagnóstico precoce (Reina et al, 2009). Todos os sete animais foram sorologicamente positivos de acordo com o teste western blot. Comexceção do animal Fe1, todos os animais foram também positivos no sangue para o RNA viral da CAE. Por outro lado, os animais Ma1-3 e Fe1-2foram positivos no líquido céfalorraquidiano e os animais Ma4-5, negativos. Dessa forma, sempre, em pelo menos uma das amostras (sangue e/oulíquor), os animais foram positivos pelo RT-nested PCR, demonstrando a aplicabilidade deste teste molecular no caso de animais sintomáticos.CONCLUSÕESA RT-nested PCR, uma técnica molecular, permite fazer o diagnóstico da CAE a partir de amostras distintas (sangue, líquido cefalorraquidiano eoutras). Além disso, mostrou-se importante na confirmação de testes sorológicos em animais sintomáticos que já soroconverteram e que aindapossuem carga viral razoável. A técnica molecular também abre a perspectiva de diagnóstico precoce de animais ainda assintomáticos que tiveramcontato com animais positivos para a doença.REFERÊNCIASANDRIOLI, A.  Vírus da artrite encefalite caprina: PCR e isolamento em amostras de sêmen, fluido uterino e embriões. Belo Horizonte, MG: UFMG -Escola de Veterinária, 2001. 68p. Tese (Doutorado).BARLOUGH, J., EAST, N., ROWE, J.D.; VAN HOOSEAR, K.; DEROCK, E.; BIGORNIA, L.; RIMSTAD, E. Double-nested polymerase chain reactionfor detection of caprine arthritis-encephalitis virus proviral DNA in blood, milk, and tissues of infected goats. Journal of Virology Methods, v.50,p.101-114, 1994.PUGH, D. C. Sheep & Goat Medicine. Philadelphia: Saunders, 2002. 468 p. REINA, R. ; BERRIATUA, E.; LUJÁN, L.; JUSTE, R. SÁNCHEZ, A.; ANDRÉS, D.; AMORENA, B. Prevention strategies against small ruminantlentiviruses: An uptade. The Veterinary Journal , v. 182, p. 31-37, 2009.XII Encontro de Iniciação Científica 2010 ISSN: 2178-1753 Universidade Estadual Vale do Acaraú - UVA [1]

Avaliação do RT-nested PCR como método de diagnóstico da artrite-encefalite caprina em cabritos com sintomatologia nervosa.

Avaliação do RT-nested PCR como método de diagnóstico da artrite-encefalite caprina em cabritos com sintomatologia nervosa.

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