RECH, D. V.

VAZ, C. S. L.

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Técnicas laboratoriais para isolamento de Campylobacter em material avícola.

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Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura 21  TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA ISOLAMENTO DE Campylobacter EM MATERIAL AVÍCOLA  Daiane Voss-Rech* e Clarissa Silveira Luiz Vaz Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC *daiane.rech@embrapa.br  O gênero Campylobacter tem sido reconhecido mundialmente como agente de enterocolite humana transmitida por alimentos. Sua importância como doença transmitida por alimentos é crescente e simultaneamente crescem os esforços laboratoriais para detecção do patógeno. Diversos métodos de coleta e isolamento vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de obter melhores resultados na detecção bacteriológica de Campylobacter. Inúmeras variações dos métodos microbiológicos convencionais (ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD, 2010; INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2006; USDA/FSIS, 1998), técnicas de cultura seletiva como passagem por membrana filtrante e centrifugação (BOLTON, et al., 1988; STEELE; MCDERMOTT, 1984) ou associação destas (MÉGRAUD, 1987; SPEEGLE, et al., 2009) vêm sendo utilizadas para o isolamento de Campylobacter. Apesar das inúmeras possibilidades metodológicas, a divergência entre os resultados e a inexistência de um método de referência para amostras de origem aviária dificultam a definição do método de isolamento a ser utilizado no laboratório. Como suporte à linha de pesquisa com Campylobacter, na Embrapa Suínos e Aves, foi necessário desenvolver estudos para selecionar um protocolo para o isolamento de Campylobacter a partir de amostras de origem aviária. A seguir descreveremos os resultados desta experiência.   Coleta e transporte das amostras As condições de coleta e transporte de amostras destinadas à análise microbiológica de Campylobacter devem considerar algumas características deste gênero. São bactérias que requerem baixa tensão de oxigênio para multiplicação. São sensíveis a concentrações superiores a 2% de NaCl a 30-35ºC ou 1% a 4ºC. O pH ótimo está entre 6,5 e 7,5 e são sensíveis à desidratação (HOLT, 1994). Sobrevivem melhor em baixas temperaturas, porém são sensíveis ao congelamento (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2006; HUNT; ABEYTA, 1995).  Sendo assim, as amostras coletadas devem ser transportadas sob refrigeração e processadas rapidamente. Amostras íntegras, como cecos ou carcaças de frango podem ser embaladas e transportadas em sacos plásticos. Amostras naturalmente mais expostas às condições ambientais, como suabes de cloaca e de arrasto, devem ser transportadas em meio de conservação. Ágar Cary-Blair e Caldo Peptonado Tamponado 1% (CPT) são boas soluções como meio de transporte sólido e líquido, respectivamente, pois são de fácil acesso aos laboratórios e apresentam capacidade tamponante, que favorece a manutenção das amostras até o processamento.   Um estudo sobre a colonização de frangos de corte por Campylobacter demonstrou que a detecção da bactéria ocorreu a partir da terceira semana, sendo possível estimar o percentual de suabes de cloaca positivos, aumentando gradativamente a partir da detecção dos primeiros positivos e atingindo quase 100% do lote no pré-abate (VAZ, et al. 2012a) (Figura 1), sendo este o período mais indicado para a coleta das amostras.          22 Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura            Figura 1. Percentual de suabes de cloaca positivos para Campylobacter em três lotes de frangos conforme modelo logístico ajustado.   Isolamento laboratorial  Aspectos gerais  O isolamento de Campylobacter demanda que o laboratório disponha de algumas condições mínimas, como geradores de microaerofilia ou mistura gasosa adequada (N2:85%, O2:5% e CO2:10%) (Figura 2), meios de cultura e antimicrobianos específicos, amostras controle e treinamento laboratorial.            Ilustração: Alexandre Matthiensen/Embrapa Figura 2. Equipamentos e acessórios utilizados na Embrapa Suínos e Aves para geração e manutenção de condições microaerófilas no cultivo de Campylobacter  Existem três principais fatores que dificultam o isolamento de Campylobacter:   1. Amostras muito contaminadas com flora competitiva;  2. Amostras com baixo número de micro-organismos;  3. Células injuriadas pelas condições de armazenamento e processamento (congelamento, dessecação, aquecimento, acidificação e exposição ao oxigênio) (ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD, 2010; THEOPHILO; JAKABI, 2008).   O uso de antimicrobianos e antifúngicos nos meios de cultura é indispensável para reduzir a flora contaminante, dentre os quais podemos citar: trimetoprim, vancomicina, anfoteracina B, cefalotina, polimixina B, cefoperazona, rifampicina e outras. Suplementos redutores de oxigênio como sulfato ferroso, metabissulfito e piruvato de sódio, hemina, sangue e carvão bacteriológico também são componentes de alguns meios de cultura (HUNT; ABEYTA, 1995).      Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura 23  Nossa experiência  Material de campo Um trabalho foi desenvolvido para avaliar a eficiência de diferentes meios seletivos e estratégias de isolamento para detecção de Campylobacter termófilos em material avícola, rotineiramente usado em pesquisas ou monitorias microbiológicas de aves (cama de aviário, fezes, suabes de cloaca e de arrasto). O estudo demonstrou que amostras de fezes, suabe de cloaca e suabe de arrasto coletados de lotes de frangos a partir de quatro semanas de idade apresentaram maior frequência de isolamento da bactéria (Figura 3) (VAZ, et al., 2012b) e seriam os mais adequados para monitoria de Campylobacter em frangos de corte.                        PD: plaqueamento direto; EC: enriquecimento seletivo por 24h e 48h de incubação; AP: Agar Preston;  ACL: Agar Campy-Line; mCCDA: Agar Carvão Cefoperazona Deoxycolato modificado Figura 3. Detecção de Campylobacter termófilos em amostras de origem aviária conforme diferentes estratégias e meios seletivos para isolamento bacteriológico  O mesmo trabalho demonstrou que para as amostras de cama de aviário o plaqueamento direto (PD) em Ágar Preston foi o mais efetivo para detecção de Campylobacter (p<0,05). Para as demais amostras não houve diferença estatística entre os três meios seletivos analisados no PD. Para as amostras de suabes de cloaca e de arrasto não houve diferença estatística entre o plaqueamento direto ou o enriquecimento em Caldo Bolton (EC) por 24h em Ágar Preston. Em relação à cama e fezes, o PD foi mais eficiente no isolamento de Campylobacter se comparado ao EC 24h, independente do meio seletivo utilizado.  Por outro lado, o EC por 48h não favoreceu o isolamento de Campylobacter em cama de aviário, fezes, suabes de arrasto e de cloaca em relação ao PD e ao EC por 24h (Figura 3) (VAZ, et al., 2012b). Esse resultado sugere que o tempo de incubação no enriquecimento em caldo é um fator importante: a partir de 24h a flora competitiva aumenta reduzindo os índices de isolamento de Campylobacter, que ficam ainda menores após 48h (ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD, 2010; VAZ, et al., 2012b).     0%25%50%75%100%PD EC 24h EC 48hFezes AP ACL mCCDA0%25%50%75%100%PD EC 24h EC 48hSuabe de cloaca AP ACL mCCDA0%25%50%75%100%PD EC 24h EC 48hSuabe de arrasto AP ACL mCCDA0%25%50%75%100%PD EC 24h EC 48hCama de aviário AP ACL mCCDA24 Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura   O plaqueamento direto facilita o isolamento de Campylobacter por inibir a proliferação exacerbada de contaminantes naturalmente presentes na amostra, entretanto, é descrito como não suficientemente sensível para a detecção em amostras com baixa concentração do micro-organismo. O enriquecimento seletivo favorece o isolamento de Campylobacter nestas amostras (THEOPHILO; JAKABI, 2008). Assim, a combinação do PD e do EC por 24h pode ser avaliada para aumentar a probabilidade de isolamento.   Baseado nesses resultados e considerando o ganho em termos de custo e tempo de execução do ensaio, o plaqueamento direto em dois meios seletivos com diferentes composições de suplementos seletivos (ex. AP e mCCDA) pode ser recomendado como primeira opção para detecção de Campylobacter em cama de aviário, fezes, suabes de arrasto e de cloaca; podendo ser associado ao EC 24h para análise de suabes de cloaca e de arrasto. O protocolo utilizado na Embrapa Suínos e Aves para isolamento de Campylobacter em amostras aviárias segue o fluxograma descrito na Figura 4.                               Figura 4. Fluxograma do isolamento de Campylobacter termófilos de amostras de origem aviária utilizado pela Embrapa Suínos e Aves          Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura 25  Carcaças e cortes de frango Em relação a alimentos, existem métodos validados para análise qualitativa de Campylobacter, dos quais o mais conhecido é o padronizado pela International Organization for Standardization (ISO) (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2006). Porém, alguns autores relatam resultados variáveis com esse protocolo (GRITTI, et al., 2011; MORAN, et al., 2009). O fluxograma deste método está apresentado na Figura 5. Nesse tipo de material é preconizada a pré-incubação em caldo seletivo por 4h a 37ºC em microaerofilia (BOLTON, 2000; HUMPHREY, 1989; INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2006;), evitando meios com rifampicina e polimixina, para recuperação das células lesadas que podem tornar-se sensíveis à temperatura de 42ºC e a esses antibióticos (ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD, 2010). O tempo de 4h deve ser limitante para evitar o crescimento exacerbado de contaminantes ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD, 2010; GOOSENS; BUTZLER, 1992; THEOPHILO; JAKABI, 2008).  O preparo da suspensão inicial é realizado pela rinsagem do produto inteiro ou amostragem a partir de 5-10g de fragmentos da pele do pescoço, os quais são homogeneizados em um diluente, como Caldo Peptonado Tamponado, a partir do qual uma parte é retirada e adicionada a nove volumes de Caldo Bolton. A recomendação para os cortes de frangos é utilizar fragmentos da superfície adicionados de nove volumes de Caldo Peptonado Tamponado (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2003).                             Figura 5. Fluxograma do isolamento de Campylobacter termófilos de amostras de alimentos e ração animal, conforme ISO 10272-1:2006. Adaptado de Humphrey et al. (2007).       26 Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura   Identificação das colônias Colônias de Campylobacter não são hemolíticas, podem ser: lisas, convexas, brilhantes e com bordas perfeitas; ou ainda planas, translúcidas e lustrosas, com bordas irregulares e espalhadas. Geralmente são incolores, com tonalidades creme ou acinzentada, e diâmetro de 1-2 mm, podendo ainda ser puntiformes com 4-5 mm.  As células são móveis, Gram negativas, delgadas, curvas ou em forma de “S” ou de asa de gaivota, geralmente formando pequenas cadeias em zig-zag. Por esta morfologia particular o exame microscópico é um grande aliado no diagnóstico presuntivo de Campylobacter. Células velhas ou injuriadas podem apresentar-se cocóides e de multiplicação mais lenta.   Confirmação das colônias Campylobacter não metaboliza açúcares, portanto a maioria das provas bioquímicas rotineiramente disponíveis nos laboratórios não são aplicáveis. Colônias com morfologia características devem ser semeadas em ágar sangue n°2 (AS) ou ágar Colúmbia (AC) com ou sem adição de sangue para confirmação pelas provas de catalase, oxidase e motilidade. A morfologia celular associada às provas confirmatórias costuma ser suficiente para diferenciar Campylobacter da maioria das espécies contaminantes, sendo recomendável associar os testes de crescimento microaeróbico a 25ºC e aeróbico a 41,5ºC para diferenciação de bactérias do gênero Arcobacter, filogeneticamente relacionado à Campylobacter.   Para diferenciar as espécies de C. jejuni, C. coli e C. lari são realizadas as provas de hidrólise do hipurato e acetato de indoxil. O teste de sensibilidade a cefalotina e ácido nalidíxico é descrito como prova diferencial das espécies de Campylobacter (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION, 2006), sendo a resistência a cefalotina uma característica do gênero e ao ácido nalídixico variável conforme a espécie. Na prática, observamos alta frequência de isolados de campo resistentes ao ácido nalídixico, independente de espécie, o que recomenda cautela no uso e na interpretação desse teste como diferencial.  Outro teste que pode ser útil para a confirmação de colônias é a prova de aglutinação em látex, comercializada em kit. Kits comerciais para identificação também estão disponíveis (APY CAMPY- Biomeuriex), assim como kits de detecção por imunoensaio enzimático (CAMPY - Meridian Bioscience; ProSpecT - Remel e ImmunoCard - Meridian Bioscience), além de outros. Nestes casos, entretanto, o custo por amostra pode ser um fator limitante ao uso em menor escala.   Manutenção e estoque dos isolados Campylobacter não tolera a exposição ao oxigênio atmosférico, portanto uma alternativa prática para manter os isolados viáveis em curto prazo, durante a rotina laboratorial, é o Caldo Brucella semi-sólido (CBSS) (HUNT; ABEYTA, 1995). As colônias semeadas em CBSS multiplicam-se lentamente abaixo da superfície do meio, permanecendo viáveis a 37°C por até 15 dias. O meio de congelamento, composto por caldo nutriente, extrato de levedura, soro fetal bovino e FBP (sulfato ferroso, piruvato de sódio e metabisulfito de sódio) é uma alternativa para estocar as amostras em longo prazo à -70ºC (HUNT; ABEYTA, 1995).   Conclusão O estabelecimento da rotina laboratorial para isolamento de Campylobater demanda tempo e perseverança e os resultados obtidos podem variar significativamente de acordo com o método utilizado. Contudo, o diagnóstico laboratorial de Campylobacter pode ser feito com segurança quando técnicas e métodos laboratoriais são avaliados e utilizados adequadamente.     Anais do Workshop de Diagnóstico Microbiológico de Campylobacter Aplicado à Avicultura 27  Referências bibliográficas  ADVISORY COMMITTEE ON THE MICROBIOLOGICAL SAFETY OF FOOD. The isolation of Campylobacter spp. from food and environmental samples. Surveillance Working Group. Discussion Paper ACM/994. 2010.   BOLTON, F. J. Methods for isolation of campylobacters from humans, animals, food and water. In: The increasing incidence of human campylobacteriosis Report and Proceedings of a WHO Consultation of Experts. Copenhagen Denmark, p. 87-93. 2000.  BOLTON, F. J.; HUTCHINSON, D. N.; PARKER, G. Reassessment of selective agars and filtration techniques for isolation of Campylobacter species from faeces. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, v. 7, p. 155–160. 1988.  GOOSENS, H.; BUTZLER, J. P. 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Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter spp. – Part 1: detection method. (ISO 10272-1:2006 [E]). Geneva: ISO, 2006. 16 p.  INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. (ISO 6887-2) Geneva: ISO, 2003.   MÉGRAUD, F. Isolation of Campylobacter spp. from pigeon feces by a combined enrichment-filtration technique. Applied and Environmental Microbiology, v. 53, p. 1394–1395. 1987.  MORAN L.; KELLY C.; MADDEN R. H. Factors affecting the recovery of Campylobacter spp. from retail packs of raw, fresh chicken using ISO 10272-1:2006. Letters in Applied Microbiology, v. 48, p. 628-632, 2009.  SPEEGLE, L.; MILLER, M. E.; BACKERT, S.; OYARZABAL, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. from naturally contaminated retail broiler meat. 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Dynamics of thermophilic Campylobacter colonization in broiler flocks reared on reused litter. World’s Poultry Science Journal, v. 68, n. 1, 2012.  VAZ, C.S.L.; VOSS-RECH, D.; POZZA, J. S.; SANTOS, F. B. O.; COLDEBELLA, A.; SILVA, V. S. Frequency of thermophilic Campylobacter in commercial broiler farms in southern Brazil using different culturing techniques and selective media. World’s Poultry Science Journal, v. 68, v. 1, p. 268-270. 2012.   

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