ARAÚJO, F. H. de

ARAÚJO, R. V. de

AZEVEDO, H. C.

CARNEIRO, P. C. F.

FERNANDES, D. L.

MARIA, A. N.

MORAIS, C. A. R. S.

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III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros132Taxa de Diluição e Tipo de Recipiente de Envase na Criopreservação do Sêmen de TambaquiFlavia Hipolito de Araujo1; Carlos Adriano Rocha Silva Morais2; David Lopes Fernandes3; Rafael Venâncio de Araújo4; Paulo César Falanghe Carneiro5; Hymerson  Costa Azevedo6; Alexandre Nizio Maria7ResumoA taxa de diluição do sêmen em relação à solução crioprotetora e o volume dosrecipientes de acondicionamento são fatores que afetam a qualidade espermáticado sêmen no processo de criopreservação. A resposta das diferentes espécies a esses fatores é bastante variável, e o estudo desse parâmetro é importante para o aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação. O objetivo do estudo foi avaliar os parâmetros de cinética espermática do sêmen de tambaqui, submetido a diferentes taxas de diluição sêmen : solução crioprotetora e criopreservado emrecipientes de diferentes volumes. O sêmen de nove machos foi coletado e diluído1:1, 1:4, 1:9 ou 1:19, em solução crioprotetora (metilglicol, glicose e gema deovo) e envasado em criotubos de 1,6 e 5,0 mL ou macropalhetas de 4,0 mL. Ocongelamento foi realizado em botijão de vapor de nitrogênio líquido (dry shipper)e o descongelamento em banho maria a 60°C por 90 s (criotubos de 1,6 e 5,0) ou 24 s (macropalheta). As amostras fora ativadas com bicarbonato de sódio 230 mM e analisadas quanto à cinética espermática através do programa Sperm Class Analyser (SCA®). As diluições 1:4 e 1:9 foram as que obtiveram melhores resultados com relação aos parâmetros de cinética espermática avaliados, nãosendo detectada diferença signifi cativa (p>0,05) entre os recipientes de 1 Graduando em Engenharia de Pesca, Bolsista FAPITEC/Embrapa Tabuleiro Costeiro, Aracaju, SE, fl aviahipolito@hotmail.com.2 Graduando em Engenharia de Pesca, bolsista FAPITEC/Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.3 Graduando em Medicina Veterinária, Bolsista Cnpq/ Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.4 Zootecnista, doutor, pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.5 Engenheiro-agrônomo, doutor em Zootecnia, pesquisador Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.6 Médico-veterinário, doutor em Medicina Veterinária, pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.7 Zootecnista, doutor em Zootecnia, pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 133armazenamento. O sêmen de tambaqui pode ser criopreservado com sucesso quando diluído 1:4 ou 1:9 (sêmen : solução crioprotetora) e envasado em criotubos de 1,6 e 5,0 mL ou macropalhetas 4 mL.Palavras-chave: Colossoma macropomum, criopreservação, taxa de diluição, criotubos, peixe.IntroduçãoO Tambaqui Colossoma macropomum é uma espécie nativa da bacia amazônica e possui grande importância na piscicultura continental do Brasil. Atualmente diversos estudos relacionados à reprodução, como indução hormonal, caracterização espermática e criopreservação do sêmen têm sido realizados (MARIA et al., 2010; 2011). No processo de criopreservação, o sêmen é diluído em solução crioprotetora antes do congelamento, na tentativa de diminuir os danos causados as célulasespermáticas devido à diminuição brusca de temperatura. Essas soluções podemser classifi cadas como crioproterores intra ou extracelulares. Os intracelulares são aqueles que protegem os espermatozoides durante o congelamento e atuamna diminuição do ponto de congelamento da água, reduzindo o estresse osmóticoe os efeitos da cristalização sobre a estrutura celular (LINHARES, 2012), como é o caso do glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO) e metilglicol. Já os extracelulares são responsáveis pela proteção da membrana celular contra o choque térmico, sendo que os mais utilizados são a gema de ovo e o leite desnatado. A proporção da diluição entre o sêmen e a solução crioprotetora, embora variávelentre pesquisadores, é um detalhe metodológico importante porque pode signifi car um melhor aproveitamento do sêmen, na caracterização de uma possível“dose fertilizante”, como ocorre para ejaculados de mamíferos. Em peixes, estavariação também ocorre e são observadas variações em relação à qualidade espermática de uma mesma espécie em resposta a diferentes taxas de diluiçãoempregadas. Nesse sentido, o estudo da melhor taxa de diluição do sêmen emrelação à solução crioprotetora, busca uma proporção que ao mesmo tempoproteja as células contra as crioinjúrias causadas pelo processo de congelamentoe maximize o número de células por recipiente de armazenamento. O uso detaxas de diluição adequadas associadas à utilização de recipientes de III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros134armazenamento do sêmen de maior volume como criotubos e macropalhetas, contribui para o aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação, facilitando ointercâmbio de material genético necessário para os programas de melhoramento,além de maximizar as atividades de rotina de produção de alevinos nas pisciculturas.O objetivo do trabalho foi avaliar os parâmetros de cinética espermática do sêmende tambaqui, submetido a diferentes taxas de diluição do sêmen em relação àsolução crioprotetora, quando criopreservado em recipientes de diferentes volumes.Material e MétodosNove machos adultos pertencentes a Piscicultura Santa Clara (Propriá, SE), foramselecionados e induzidos hormonalmente. Dez horas após a indução o sêmen decada macho foi coletado em tubos de ensaio por massagem abdominal, tomando-se os devidos cuidados para evitar contaminação por fezes, urina ou água. Para a seleção das amostras de sêmen utilizadas, inicialmente foi avaliada a presença de motilidade espermática removendo-se cinco μL de sêmen de cada macho e levado a visualização em lâmina sob microscópio óptico (400X) e ativadas com bicarbonato de sódio 230 mM. As amostras que apresentaram pré-ativação da motilidade foram consideradas contaminadas, sendo portando descartadas e selecionadas apenas as que obtiveram 80% de motilidade. Depoisde selecionada as amostra de sêmen foram feitos três pool, sendo cada pool composto com sêmen de três animais.As amostras de cada pool foram diluídas nas proporções de 1:1, 1:4, 1:9 e 1:19em solução de congelamento a base de glicose 5%, metilglicol e gema de ovo eenvasados em criotubos de 1,6 e 5 mL e macropalheta de 4 mL. Após 20 minutosde contato do sêmen com a solução de criopreservação, as amostras foram congeladas em botijão de vapor de nitrogênio líquido (dry-shipper) de acordo como protocolo proposto por MARIA e outros, 2011. Para o descongelamento asamostras foram submetida ao banho maria a 60 °C durante 90 segundos (criotubos 1,6 e 5,0 mL) ou 24 segundos (macropalhetas 4,0 mL). Após o descongelamento a cinética espermática de cada amostra foi avaliada pelo analisador computadorizado de sêmen Sperm Class Analyzer - SCA® utilizando-secomo solução ativadora o bicarbonato de sódio 230 mM. Os seguintes parâmetrosforam avaliados: motilidade total (MT - %); motilidade progressiva (MP - %); III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 135velocidade curvilinear (VCL - μm/s); velocidade em linha reta (VSL - μm/s) e;velocidade de trajeto (VAP - μm/s). Espermatozóides que apresentaram velocidadenão progressiva (entre 20 a 60 μm/s) foram classifi cados como lentos; com velocidade progressiva lenta (entre 60 e 100 μm/s) como média; e com velocidadeprogressiva rápida (acima de 100 μm/s) como rápida. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados em um sistemafatorial: 4 x 3 (4 taxas de diluição sêmen : solução de criopreservação x 3 recipientes de armazenamento do sêmen). Os dados foram submetidos à análisede variância e, em caso de diferença signifi cativa, foi aplicado o teste Tukey, com 5% de signifi cância pelo software estatístico SISVAR.Resultados e DiscussãoAs diluições 1:4 e 1:9 (sêmen : solução crioprotetora) foram as que obtiveram melhores resultados com relação aos parâmetros de cinética espermática avaliados, não sendo detectada diferença signifi cativa (p>0,05) entre os recipientes de armazenamento testados (criotubos 1,6 e 5,0 e macropalhetas 4,0 mL). Os parâmetros de cinética espermática do sêmen de tambaqui pós-congelamento estão descritos na Tabela 1.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros136Tabela 1. Parâmetros de cinética espermática do sêmen de tambaqui criopreservado emrecipientes de diferentes volumes submetidos a diferentes taxas de diluição sêmen: soluçãode criopreservação.A-B a-b Médias seguidas por letras distintas, maiúsculas na coluna e minúsculas nas linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).ParâmetroRecipiente(Tipo/mL)Diluição1:1 1:4 1:9 1:19MT (%)Criotubo 1,6 45±6 54±9 55±6 38±1 48 ACriotubo 5,0 46±1 51±2 49±11 41±4 47 AMacropalheta 4,0 49±8 49±11 59±15 45±11 50 AMédia 46 ab 51 ab 54 a 41 bMP (%)Criotubo 1,6 15±7 25±7 30±4 11±2 20 ACriotubo 5,0 14±3 23±1 22±10 9±3 17 AMacropalheta 4,0 19±6 19±6 29±13 15±7 20 AMédia 16 bc 22 ab 27 a 12 cVCL (μm.s-1)Criotubo 1,6 67±11 77±6 85±1 59±6 72 ACriotubo 5,0 66±7 76±1 76±11 56±8 69 AMacropalheta 4,0 73±7 73±9 82±12 63±6 73 AMédia 69 bc 76 ab 81 a 59 cVSL (μm.s-1)Criotubo 1,6 37±12 51±7 57±3 34±6 45 ACriotubo 5,0 37±7 51±1 48±11 28±8 41 AMacropalheta 4,0 44±7 46±9 54±12 38±6 45 AMédia 39 bc 49 ab 53 a 33 cVAP (μm.s-1)Criotubo 1,6 51±13 64±7 72±3 44±6 58 ACriotubo 5,0 50±7 64±3 61±12 39±8 54 AMacropalheta 4,0 58±9 60±11 67±12 48±8 58 AMédia 53 bc 63 ab 67 a 44 cNo presente estudo a motilidade subjetivas no sêmen in natura de todos os machos foram acima de 80% sendo considerado o ideal para a criopreservação. E o volume de sêmen coletado foi de 45,4 mL. De acordo com BALL (2001) as diferentes formas e materiais dos recipientes dearmazenamento de podem resultarem em diferentes taxas de transferências decalor com congelado e descongelado, mas não foi observada diferença signifi cativapara esses parâmetros em nenhum das diluições utilizada pra sêmen de Tambaqui,quando avaliado a cinética espermática das células.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros 137A taxa de diluição 1:10 (sêmen: volume total)  foi utilizada para sêmen pirapitinga,e a após o descongelamento obteve-se um elevada taxa de motilidade (OLIVEIRART al., 2007). Já para a piracanjuba essa diluição não apresentou motilidade elevada, sendo a melhor à taxa de diluição 1:5 (MARIA et al., 2006).Vieira (2010) encontrou para sêmen de Tambaqui a maior porcentagem deespermatozoide moveis após o descongelamento a taxa de diluição 1:3 quandoutilizado diluentes a base de água de coco em pó (ACP-104), no atual experimentofoi observado que as diluições de 1:4 e 1:9 mostrou-se superior para os parâmetrosde cinéticas espermáticas.ConclusãoO sêmen de tambaqui pode ser criopreservado com sucesso quando diluído 1:4 ou 1:9 (sêmen : solução crioprotetora) e envasado em criotubos de 1,6 e 5,0 mL ou macropalhetas de 4 mL. Entretanto, para um melhor aproveitamento do sêmen indica-se a utilização de criotubos de 5,0 mL e diluição 1:4, o que confere a capacidade de fertilizar um maior número de ovócitos por amostra criopreservada.ReferênciasBALL, B. A.; VO, A. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects ofsoluble cryoprotectant on equine sperm motility, viability and mitochondrial membrane potential. Journal of Andrology, Lawrence, US, v. 22, p. 1061-1069,2001.HUNTER, R. H. F. Fisiologia e tecnologia da reproducao da femea dos animais domésticos. Zaragoza, ES:  Acribia, 1982.LINHARES, F. R. A. Efeito de diferentes taxas de diluição e protocolos de congelação sobre a cinética e morfologia de espermatozoides de Carpa Comum(Cyprinus carpio) criopreservados em água de coco em pó (ACP-104). 2012.81 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias) - UniversidadeEstadual do Ceará, Fortaleza, 2012.III Seminário de Iniciação Científi ca e Pós-Graduação da Embrapa Tabuleiros Costeiros138MARIA, A. N.; AZEVEDO, H. C.; CARNEIRO, P. C. F. Protocolo para Criopreservação do Sêmen de Tambaqui (Colossoma macropomum). Aracaju: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2011. (Embrapa Tabuleiros Costeiros. ComunicadoTécnico, 112).MARIA, A. N.; AZEVEDO, H. C.; SANTOS, J. P.; SILVA, C. A.; CARNEIRO, P.C. F. Semen characterization and sperm structure of the Amazon Tambaqui Colossoma macropomum. Journal ofApplied Ichthyology, Berlin, v. 26, p. 779-783, 2010.MARIA, A. N.; VIVEIROS, A. T. M.; FREITAS, R. T. F. et al. Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost fi sh. Aquaculture, Amsterdan, NL, v. 260,p. 298-306, 2006.MILIORINI, A. B. Ativadores e concentrações de metanol e dimetilsulfóxido na qualidade do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus). 2006. 113 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinarias) - Universidade Federal de Larvas, MG, 2006.OLIVEIRA, V. A.; VIVEIROS, M. T. A.; MARIA, A. N., FREITAS, F. T. R.; IZAU, A. Z. Sucesso do resfriamento e congelamento de sêmen de pirapitinga Brycon nattereri. Arqivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 59, n. 6, p. 1509-1515, 2007.VIEIRA, M. J. A. F.; Caracterizacao do semen de tambaqui Colossoma macropomum (Curvier, 1818) e criopreservacao em diluentes a base de agua decoco em po (ACP-104). 2010. 114 f. Tese (Doutorado em Ciencias Veterinarias)- Universidade Estadual do Ceara, Fortaleza, 2010.

Taxa de diluição e tipo de recipiente de envase na criopreservação do sêmen de tambaqui.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/976046/1/pag.132.pdf

Taxa de diluição e tipo de recipiente de envase na criopreservação do sêmen de tambaqui.

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