ARIAS, C. A. A.

DIAS, W. P.

FARIAS, J. R. B.

FUGANTI, R.

MACHADO, M. F. P. das

MARIN, S. R. R.

MORALES, A. M. R.

NEPOMUCENO, A. L.

SILVA, J. F. V.

MACHADO, M. F. P. das.

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Análise quantitativa da expressão do gene GmHSP 17.6-L em linhagens de soja resistentes e suscetíveis ao nematóide de galhas, Meloidogyne javanica.

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7.92 	Embrapa Soja. Documentos, 276 Análise quantitativa da expressão do gene GmHSP 17.6-L em linhagens de soja resistentes e suscetíveis ao nematólde de galhas, Meloidogynejavanica Renata Fuganti" 2 ; M. E. P. da S. Machado 1 ; A. M. R. Morales 2 • 3 ; S. R. R. Marin 2 ; Waldir Pereira Dias 2 João Flávio Veloso Silva 2 ; Carlos Alberto Arrabal Arias 2 ; José Renato Bouças Farias 2 ; Alexandre Lima Nepomuceno 2 . 1 UEM - Universidade Estadual de Maringá, rfuganti©cnpso.embrapa.br ; 2 Embrapa Soja; 3 UNESP/FCAV - Jaboticabal. Introdução A produção mundial de soja cresceu, de 1970 a 2003, cerca de 333%, passando de 43,7 para 189,2 milhões de toneladas. Em 2004, o Brasil foi o segundo maior produtor mundial de soja, atrás dos EUA, e à frente daArgentina, com uma produçâo de 50 milhões de toneladas ou 25% da safra mundial, estimada em 216 milhões de toneladas (Conab, 2005; Embrapa, 2006). No entanto, alguns fatores diminuem a produtividade da cultura, destacan-do-se as doenças causadas pelos nematóides fitoparasitas, em especial os nematóides de galhas, do gênero Melo/dogyne. Os prejuízos anuais na produção mundial causados por estes patógenos são estimados em 11% devido à redução da quantidade de grãos colhidos e o aumento dos gastos com medidas de controle e defensivos agrícolas (Barker, 1998). No entanto, o método de controle mais eficiente, prático e economicamente viável ao produtor é ouso de cultivares resistentes (Ferraz, 2001). Assim, trabalhos de pesquisas visando identificar genes expressos durante a relação parasitária de nematóides e a seleção de genes de resistência a M. javanica são desejáveis para aprimoramento e obtenção de genótipos resistentes a estes fitopatógenos, sendo esta uma das principais metas dos programas de melhoramento. /1 Jornada Acadêmica da Embrapa Soja 	 193 Em trabalhos anteriores uma proteína de choque térmico de baixo peso molecular com provável função de chaperona molecular foi identificada em genótipos de soja resistentes e suscetíveis ao M. javanica. O sequen-ciamento da região promotora do gene Gmhsp 17.6-L (n° de acesso no Genbank M11317) em materiais resistentes e suscetíveis apresentou diferenças, onde uma maior inserção de repetições AT(n) foi observada nos indivíduos resistentes (Fuganti et ai., 2004). Um ensaio de proteção de ribonuclease foi feito visando determinar se a inserçãoldeleção estaria causando inativação gênica em um dos genótipos. No entanto, foi obser-vado que ambos genótipos apresentam expressão do gene Gmhspl 7. 6-L em tratamentos inoculado e não inoculado com o fjtoparasita. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar quantitativamente a expressão do gene Gmhsp17.6-L, visando identificar se o tamanho da inserção poderia estar alterando os níveis de expressão da proteína e isto estar relacionado com a resistência/suscetibilidade ao nematóide. Materiais e Métodos Utilizando a técnica de PCR em tempo real, linhagens de soja resistentes (genótipo P1595099) e suscetíveis (cultivar BRS133) ao nematôide de galhas M. javanica, e uma amostra de individuos resistentes (JF7002, .JF7027 e JF7056) e suscetíveis (256-S, 259-S e 266-S) resultante deste cruzamento foram analisados quanto à expressão do gene Gmhsp 1 7.6-L. As sementes foram colocadas para germinar em câmara de germinação e após 7 dias as plântulas foram transferidas para casa de vegetação. Em tubetes de plástico, os materiais foram inoculados com juvenis do nema-tóide, na concentração de aproximadamente 650 J 2 por planta. As coletas de material biológico foram feitas após 1, 3 e 6 dias de inocu-lação. Raízes das plantas nos tratamentos inoculado e não inoculado de todos os materiais foram coletadas e armazenadas em nitrogênio líquido. RNA total foi extraído, utilizando o reagente Trizol conforme instruções do fabricante. Em seguida foi feita a síntese de cDNA, para a análise de PCR em tempo real, utilizando primers oligodT. Para confirmação da presença do nematóide, amostras de raízes foram coradas com fucsina ácida, ob-servadas em lupa e fotografadas. 194 	 Embrapa Soja. Documentos, 276 Uma curva de eficiência foi feita com diferentes concentrações de cDNA visando determinar a concentração ideal para o PCR em tempo real. As reações de PCR para quantificação relativa foram preparadas em triplicatas utilizando um bulk de cDNAs dos três dias de coleta de raízes nos trata-mentos inoculado e não inoculado, para as diferentes amostras testadas. O gene rRNA iBS (n° de acesso no Genbank X02623.i ) foi utilizado como controle endógeno. Todas as análises de expressão gênica foram feitas utilizando-se o software SDS (Applied Bíosystems, Foster, CA, USA). Para análise dos parentais, a expressão do parental resistente P1595099 não inoculado, (valor i) foi utilizado como calibrador e para a análise da popu-lação o calibrador utilizado foi a amostra resistente JF7056 não inoculado (valor 1). Resultados e Discussão A coloração das raízes com fuscina ácida comprovou que a inoculação com o J 2 do nematáide Me!oidogyne javanica foi eficiente, pois em todos os materiais inoculados a presença do nematólde foi observada, tanto nos parentais como nos indivíduos da população. Os resultados demonstram que comparando-se as amostras resistentes e suscetíveis, o gene possui maior expressão nos genótipos resistentes inoculados, tanto para os parentais (Gráfico 1) como para a população (Gráfico 2). Estes resultados sugerem, portanto, que a presença das repetições AT(n) na região promotora do gene Gmhsp17.6-L pode de alguma forma favore-cer uma maior expressão desta proteina na presença do nematóide e uma vez que chaperonas moleculares participam de processos celulares que promovem a proteção da célula em situações de estresse, este mecanismo pode estar relacionado com a maior/ menor resistência a nematóides. II Jornada Acadêmica da Embrapa Soja 	 195 9,0 O Inoc 8,0 DNInoc 7,0 6,0 CY 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 ETTknn r 	 1 , 6R8133 	 P1595099 Amostras Gráfico 1. Quantificação relativa do gene Gmhsp 17.6-L para os parentais susce-tível, BRS1 33 e resistente, P1595099, nos tratamentos inoculado e não inoculado com juvenis do nematóide M. javanica. O cDNA utilizado nas reações consistia em bulks das três datas de coletas após a inoculação com juvenis do nematóide. 90 8,0 Dlnoc flNlnoc - 7,0 - 6,0 050 co rZ 4,0  (o I I ff 	 !flff Li,I:ansj SLtà 256$ 	 259$ 	 266$ 	 JF7002 	 JF7027 	 JF7056 Amostras Gráfico 2. Quantificação relativa do gene Gmhsp 17.6-L para os indivíduos susce-tíveis (2565, 2595 e 2665) e individuos resistentes (JF7002, JF7027 e JF7056), da população resultante do cruzamento BRS1 33 x P1595099, nos tratamentos inoculado e não inoculado com juvenis do nematóide M. javanica. . O cDNA utilizado nas reações consistia em bulks das três datas de coletas após a inoculação com juvenis do nematóide. 196 	 Ernbrapa Soja. Documentos, 276 Referências BARKER, K. R. Introduction. In: BARKER, K. R.; PEDERSON, G. A. e WINDHAM, G. L. Plant and nematode interactions. Madison: American Society ofAgronomy, p. 1-20, 1998. CONAB - Companhia Nacional de Abastecimento. Disponível no site <www. conab.gov.br> 2005. EMBRAPA- EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISAAGROPECUÁRIA. Disponível em <www.cnpso.embrapa.br > 2006. Acesso em julho de 2006. FERRAZ, L. C. C. B. As meloidoginoses da soja: passado, presente e futuro. In. SILVA, J. F. \J; MAZAFFERA, R; CARNEIRO, R. G.; ASMUS, G. L.; FERRAZ, L. C. C. B. Relações parasito-hospedeiro nas meloi-doginoses da soja. Londrina: Embrapa Soja: Sociedade de Nematologia, 127 p, 2001. FUGANTI, R.; BENEVENTI, M. A.; SILVA, J. F. V.; ARIAS, C. A. A.; MARIN, S. R. R.; BINNECK, E.; NEPOMUCENO, A. L. Microsatellite insertion in a heat shock protein promoter region (Gmhsp 17.6-1—) in soybean plants resitant and susceptible to Meloidogyne javanica. In: VII World Soybean Research Conference - IV International Soybean Processing and Utilization Conference- III Brazilian Soybean Congress, 2004, Foz do Iguaçu- PR. Proceedings of VII World Soybean Research Conference - IV International Soybean Processing and Utilization Conference- III Brazilian Soybean Congress, 2004. 

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