BITENCOURT, H. R.

SANTOS, L. da S.

SOUZA FILHO, A. P. da S.

VERZIGNASSI, J. R.

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ATIVIDADE FUNGISTÁTICA DE CHALCONAS A FITOPATÓGENOS A CULTIVOS AMAZÔNICOSHeriberto  Rodrigues  Bitencourt1 (eriberto@ufpa.br),  Jaqueline  R.  Verzignassi2 (jaque@cpatu.embrapa.br),  Antonio Pedro Souza Filho2 (apedro@cpatu.embrapa.br), Lourivaldo da Silva Santos1 (lss@ufpa.br).1. Universidade Federal do Pará, Campus Universitário do Guamá, Rua Augusto Côrrea, 01, 66075-110, CP. 479 Belém – PA2. Embrapa Amazônia Oriental, Tv. Enéas Pinheiro, S/N, CEP 66095-100  Belém - PA INTRODUÇÃOA maioria das chalconas e seus derivados apresentam atividades biológicas. A molécula 4´-etóxi-2´-hidróxi-4,6´-di-metóxi-chalcona, por exemplo, é ativa contra cepas de rinovírus (associadas a resfriados) (Ishitsuka et al., 1982a). Tal chalcona foi obtida após modificações moleculares na estrutura química da flavona 4’,5-di-hidróxi-3,3’,7-tri-metóxi-flavona, isolada da planta agastache (Agastache rugosa Kuntze), que apresenta potente atividade contra o picornavírus (Ishitsuka et al., 1982b). Já, a chalcona 2´,4´-di-hidróxi-6-metóxi-chalcona, isolada da planta Boesenberg rotuda (L.) (Zongiberaceae), possui a capacidade de inibir a protease NS3 do vírus da dengue (DEN-2) (Kia et  al.,  2006).  De  chalconas  isoladas  de  Millettia  leucantha (Leguminoseae)  foi  relatada  atividade moderada contra o vírus da herpes simples. A inibição da replicação de HIV-1 em linfócitos-H9 de camundongos foi obtida com as moléculas 2-metóxi-3-metil-4,6-di-hidróxi-5-(3´-hidróxi)-cinamoil-benzaldeído (Wu et al., 2003) e 2-hidróxi-3-metóxi-chalcona (Deng et al., 2006). Lall et al. (2006) ralatam a atividade de chalconas contra o vírus influenza (Infl A).A estes compostos são também relatadas ação antagônica a fungos dermatófitos (López et al., 2001), proteção das células do trato gastroduodenal, bem como atividade antimitótica (Edwards et al., 1990) e atividade anti-plaquetária (2´,4´,6´-tri-hidróxi-chalcona).OBJETIVOAvaliar o efeito fungistático in vitro de duas moléculas do tipo chalcona em quatro fungos fitopatogênicos a cultivos amazônicos.MATERIAL E MÉTODOS1. Síntese e caracterização das chalconasAs  substâncias  sintéticas,  sob  protocolo  17  (2,6-bis-(2-metóxi-benzilideno)-ciclo-hexa-1-ona)  e  28  (2,4’-di-metóxi-chalcona),  foram  obtidas  pela  reação  de  condensação  entre  cetonas (ciclohexanona  e  4-metóxi-acetofenona,  respectivamente)  e  ortoanisaldeído,  utilizando-se  a metodologia descrita por Hathaway (1987). Para tanto, 15 mL de etanol PA, 1 mL de cetona PA, 15 mL de solução NaOH (10%) e 1,5 mL de ortoanisaldeído foram misturados em balão de fundo chato e boca esmerilhada e mantido sob agitação magnética (50 ºC/40 min.). Após, a solução foi resfriada  (–15ºC)  por  24  horas.  O  produto  reacional  (sólido-17  ou  viscoso-28)  foi  filtrado  ou decantado e lavado com água destilada para a retirada do excesso de solução NaOH. Ambos os produtos foram obtidos em bom rendimento, 90 e 75%, respectivamente.Para  a  identificação  das  estruturas  químicas  dos  produtos  obtidos,  utilizou-se  a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono -  13C (RMN1H e 13C), a espectroscopia  no  infravermelho  e  no  ultravioleta  e  a  espectrometria  de  massas.  As  referidas estruturas estão esquematizadas na Figura 1.OOMe OMe17OOMeMeO28Figura 1 – Estruturas químicas das substâncias 17 e 18.2. FitopatógenosOs  fungos  Rhizoctonia  solani,  Colletotrichum  gloeosporioides,  Fusarium  oxysporum e Crinipellis  perniciosa,  patógenos  de  caupi  (Vigna  unguiculata),  noni  (Morinda  citrifolia), pimenteira-do-reino (Piper nigrum) e cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum),  respectivamente, isolados  de  plantas  sintomáticas  no  Estado  do  Pará,  foram  utilizados  para  a  investigação  da atividade das substâncias.  Os referidos patógenos causam a mela do caupi,  antracnose do noni, murcha amarela da primenteira-do-reino e vassoura-de-bruxa do cupuaçuzeiro. Os patógenos foram multiplicados em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) e incubados, por cinco dias (26ºC/12 horas de luz fluorescente e 12 h de escuro).3. TratamentosOs testes foram efetuados em placas de Petri (9cm de diâmetro) contendo meio de cultura BDA. As substâncias foram adicionadas ao meio de cultura, na concentração de 1000 ppm, antes ou após a autoclavagem (20’/120atm). Para a substância viscosa (28) utilizou-se acetona PA para a diluição após a autoclavagem. Assim, os tratamentos efetuados foram os seguintes:1 – substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio (17NA);2 – substância 28 adicionada após a autocalvagem do meio (28NA);3 – substância 17 adicionada antes da auatoclavagem do meio (17A);4 – substância 28 adicionada antes da autoclavagem do meio (28A);5 – testemunha – meio de cultura autoclavado (T).Após a preparação,  os discos de cultura  (8 mm de diâmetro)  dos quatro isolados foram posicionados no centro das placas, sobre o meio. As placas foram, então, mantidas em câmara de incubação tipo BOD (26ºC e fotoperíodo de 12h de luz fluorescente e 12 h de escuro) e avaliadas diariamente  durante  sete  dias.  Para tanto,  o  crescimento  das  culturas  foi  mensurado (diâmetros opostos) para o cálculo do diâmetro médio das colônias. Ao final do ensaio, avaliou-se a coloração das colônias nos diferentes tratamentos. O delineamento empregado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições (cada parcela representado por uma placa) e os dados submetidos à análise de variância e teste de médias (Tukey, 5% de significância). RESULTADOS E DISCUSSÃOO fungo R. solani apresentou rápido crescimento e a testemunha completou a área total da placa ao segundo dia do plaqueamento, ou seja, logo na primeira avaliação. Para a substância 28, adicionada após a autoclavagem, o crescimento médio foi 1,89 cm, apresentando-se como o melhor tratamento,  seguido  pela  mesma  substância  submetida  à  autoclavagem  (5,66cm)  (Figura  2).  A chalcona 17 apresentou relativamente  baixo efeito  fungistático sobre o patógeno e,  quando não autoclavada, não diferiu da testemunha, apresentando valores de 8,74 cm e 9 cm, respectivamente. A  esterilização  do  meio  de  cultura  por  autoclavagem  resultou  em  perdas  das  propriedades fungistáticas  pela  substância  28,  demonstrando  a  sua  termosensibilidade.  Além  do  efeito fungistático,  foram  observadas  alterações  no  aspecto  das  colônias  no  que  tange  à  coloração, variando de marrom a marrom escura (Tabela 1).1,895,667,168,74 9,00012345678910Diâmetro médio (cm)28NA 28A 17A 17NA TFigura 2 – Diâmetro médio (cm) da colônia de Rhizoctonia solani em meio acrescido das chalconas 17 e 28, dois dias após plaqueamento. 17NA: substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio;  28NA:  substância  28  adicionada  após  a  autocalvagem  do  meio;  17A:  substância  17 adicionada antes da autoclavagem do meio; 28A: substância 28 adicionada antes da autoclavagem do meio; T: testemunha.  Média de quatro repetições, compostas por uma placa cada. Tratamentos de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade. CV: 4,49%.Os  valores  de  Área  Abaixo  da  Curva  do  Crescimento  da  Colônia  (AACCC)  de  C. gloeosporioides (Figura 3), indicam que ambas as substâncias apresentaram atividade deletéria ao crescimento micelial do patógeno em relação à testemunha, variando de 24,88 (substância 28) a 33,49 (substância 17). A inibição ao patógeno foi observada em todas as avaliações, porém não foi observada qualquer diferença no aspecto da colônia nos diferentes tratamentos (Tabela 1).24,8830,65 30,8333,4937,290510152025303540Área Abaixo da Curva do Crescimento da Colônia28NA 28A 17A 17NA TFigura 3 – Área Abaixo da Curva de Crescimento da Colônia de Colletotrichum gloeosporioides em meio acrescido das chalconas 17 e 28. 17NA: substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio;  28NA:  substância  28  adicionada  após  a  autocalvagem  do  meio;  17A:  substância  17 adicionada antes da autoclavagem do meio; 28A: substância 28 adicionada antes da autoclavagem do meio; T: testemunha.  Média de quatro repetições, compostas por uma placa cada. Tratamentos de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade. CV: 3,23%.Assim como  para  o  fungo  R.  solani (Figura  2),  F.  oxysporum apresentou  sensibilidade apenas  ao tratamento  em que se utilizou a  chalcona 28, adicionada ao meio  de cultura após a autoclavagem (Figura 3). Quando autoclavada, a substância não apresentou estabilidade ao calor, não diferindo da testemunha.  Com relação às  características  morfológicas,  a  substância  28 não autoclavada promoveu a formação de colônias cujo micélio apresentava-se tênue e de coloração menos acentuada que os demais, em especial em relação às substâncias submetidas ao calor (Tabela 1). 43,3350,95 51,254,38 54,410102030405060Área Abaixo da Curva do Crescimento da Colônia28NA 28A 17A T 17NAFigura 4 – Área Abaixo da Curva de Crescimento da Colônia de  Fusarium oxysporum em meio acrescido das chalconas 17 e 28. 17NA: substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio; 28NA: substância 28 adicionada após a autocalvagem do meio; 17A: substância 17 adicionada antes da  autoclavagem do  meio;  28A:  substância  28  adicionada  antes  da  autoclavagem do meio;  T: testemunha.   Média de quatro repetições, compostas por uma placa cada. Tratamentos de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade. CV: 4,39%.Crinipellis  perniciosa, analogamente aos fungos  R. solani e  F. oxysporum, apresentou-se altamente sensível à chalcona 28, quando não submetida à esterilização por calor. No entanto, o aspecto  cultural  das  colônias  não diferiu  nos  tratamentos,  apresentando a  coloração branca  e  a textura cotonosa (Tabela 1). 6,6614,1017,6719,3 20,150510152025Área Abaixo da Curva do Crescimento da Colônia28NA 28A 17A 17NA TFigura 5 – Área Abaixo da Curva de Crescimento da Colônia de Crinipellis perniciosa em meio acrescido das chalconas 17 e 28. 17NA: substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio; 28NA: substância 28 adicionada após a autocalvagem do meio; 17A: substância 17 adicionada antes da  autoclavagem do  meio;  28A:  substância  28  adicionada  antes  da  autoclavagem do meio;  T: testemunha.   Média de quatro repetições, compostas por uma placa cada. Tratamentos de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade. CV: 15,54%.Tabela 1 – Aspecto das colônias fúngicas nos diferentes tratamentos, sete dias após a instalação do ensaio.FungoTratamento1 Rhizoctonia solaniColletotrichum gloeosporioidesFusarium oxysporumCrinipellis  perniciosa17NA Marrom clara2Branca acinzentadaRosa, esparsoBranco, cotonoso28NA Marrom Rosa, muito esparso17A Marrom clara Rosa tendendo a violeta, cotonoso28A Marrom Rosa, esparsoTestemunha Marrom escura Violeta, cotonoso1 17NA: substância 17 adicionada após a autoclavagem do meio.   28NA: substância 28 adicionada após a autoclavagem do meio.   17A: substância 17 adicionada antes da auatoclavagem do meio.  28A: substância 28 adicionada antes da autoclavagem do meio.  2   Média de quatro repetições, compostas por uma placa cada. Conforme os  resultados  apresentados,  a  substância  17  não demonstrou  potencial  para  o controle  dos  fitopatógenos.  Já,  a  substância  28,  principalmente  quando não submetida  ao calor intenso, apresentou atividades fungistáticas significativas, bem como alterações morfológicas nas colônias. A variável  estudada (crescimento micelial)  mostrou-se bastante  aplicável  no que tange à triagem inicial (“screening”) de substâncias com potencial para o controle de fitodoenças. O efeito de diferentes concentrações da substância no controle  dos patógenos  in vitro,  a atuação dessas substâncias na produção de inóculo e na reprodução do patógeno, bem como na capacidade infectiva, na formação de estruturas de resistência e na persistência do efeito antagonista da substância, constituem, entre outros, pontos importantes a investigar. Da mesma forma, testes de eficiência  in vivo  (antes e após o estabelecimento da doença); persistência na planta (efeito residual); aspectos relativos à fitotoxicidade; estudo da estabilidade da molécula quando em formulações; a persistência  do produto no campo; residuais nos alimentos tratados; toxicidade ao ser humano e danos ao ambiente também são aspectos importantes a estudar.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1)  DENG,  J.;  KELLEY,  J.A.;  BARCHI,  J.J.;  SANCHEZ,  T.;  DAYAM,  R.;  POMMIER,  Y.; NEAMATI, N. Mining the NCI antiviral compouds for HIV-1 integrase inhibitors.  Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.14, p.3785-3792. 2006.2) EDWARDS, M.L.; STEMERICK, D.M.; SUNKARA, P.S. Chalcones: a new class of antimitotic  agentes. J. Med. Chem., v.33, p.1948-1954. 1990.3) HATHAWAY, B.A. An aldol  Condensation Experiment  Using a Number  of Aldehydes  and Ketones. J. Chem. Education., v.64, n.4, p.367-368. 1987.4) ISHITSUKA, H.;  NINOMIYA, Y.T.;  OHSAWA, C.;  FUJIU,  M.;  SUHARA, Y.  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In vitro antifungal  evaluation  and struture-activity relatioships  of a new series of chalcone derivatives and synthetic analougues, with inhibitory properties against polymers of the fungal cell wall. Bioorg. Med. Chem., v.9, p.1999-2013. 2001.9)WU,  J.-H.;  WANG,  X.H.;  YI,  Y.H.;  LEE,  K.H.  Anti-AIDS  agents  54.  A  potent  anti-HIV Chalcones  and Flavonoids  Genus Desmos.  Bioorganic  & Medicinal  Chemistry Letters,  v.13, p.1813-1815. 2003.

Atividade fungistática de Chalconas a fitopatógenos a cultivos amazônicos.

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