GUIMARÃES, S. E. F.

LOBO, A. M. B. O.

LOPES, M. S.

LÔBO, R. N. B.

PAIVA, S. R.

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18 a 22 de maio de 2009Águas de Lindóia/SPFZEA/USP-ABZ                                                                          1FREQUÊNCIA ALÉLICA DO GENE DA AROMATASE (Cyp19) EM OVINOS SANTA INÊS¹Ana Maria Bezerra Oliveira Lobo²a, Simone Eliza Faccioni Guimarães3, Raimundo Nonato Braga Lôbo4a, Samuel Rezende Paiva5, Marcos Soares Lopes6¹Pesquisa financiada pelo CNPq²Aluna do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento/Laboratório de Biotecnologia Animal/Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG. E-mail: oliveiraana@yahoo.com.braPrograma de Melhoramento Genético de Caprinos e Ovinos de Corte (GENECOC)³Profa. do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento/Laboratório de Biotecnologia Animal/Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG. sfacioni@ufv.br4Pesquisador/Embrapa Caprinos e Ovinos, Sobral, CE, Brasil/ Bolsista produtividade CNPq, E-mail: lobo@cnpc.embrapa.br5Pesquisador/Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil. E-mail: samuel@cenargen.embrapa.br6Aluno do Curso de Zootecnia/Laboratório de Biotecnologia Animal/Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG. Email:marcosmsl@hotmail.comResumo: A identificação e uso de polimorfismos em genes candidatos é uma das estratégias que podem ser usadas em melhoramento atualmente. Desta forma, um total de 279 animais da raça Santa Inês foi genotipado para o polimorfismo T242C no gene da aromatase pela técnica de PCR-RFLP/Reação em Cadeia da Polimerase – Análise de Polimorfismo no Comprimento dos Fragmentos de Restrição. A enzima DpnII foi usada como ferramenta diagnóstico para análise do sítio de restrição. Na população analisada, foi confirmada a presença de uma transição T>C no éxon 3, na posição 242 da seqüência AJ012151. A frequência dos genótipos foram: CC – 1,08% (3 animais), TC – 86,02% (240 animals) e TT – 12,90% (36 animais). Estes resultados serão usados para auxiliar a montagem e escolha de reprodutores para futuros experimentos de associação de alelos favoráveis com características quantitativas desejáveis para ovinocultura nacional.Palavras–chave: citocromo P450, estrogênio, gene candidato, Ovis ariesAbstract: PCR-RFLP was used to genotype 279 Santa Inês Sheep for T242C aromatase polymorphism. The enzyme DpnII was used as a diagnostic tool for restriction site analysis. A T>Ctransition was verified within exon 3 at position 242 of sequence AJ012151 (database accession number) according to Vanselow et al. (1999). The genotype frequencies were: CC - 1.08 % (3 animals), TC – 86.02 % (240 animals) and TT – 12.90 % (36 animals). The knowledge of  allelicfrequencies for this polymorphism will facilitate in the choice of those animals with favorable allelesfor the quantitative traits under selection.Keywords: candidate gene, cytochrome P450, Ovis aries, estrogenIntroduçãoA enzima aromatase citocromo P450 (P450arom) catalisa a conversão de esteróides C19(androstenediona, testosterona) a C18 estrógenos (estrona, estradiol), um passo primordial na biossíntese de estrogênios (Thompson & Siiteri, 1974). A P450arom é o produto de um único gene chamado Cyp19 que pertence à superfamília do citocromo P450 que contêm mais de 600 membros pertencentes a 100 famílias das quais a P450arom é o único membro da família 19. O gene Cyp19 ovino está localizado na região q24-q31 do cromossomo sete e possui um tamanho 2de 1546 bp com uma janela aberta de leitura de 1509 bp e um códon de parada da tradução,TAA. A tradução do RNA pode gerar uma proteína de 503 aminoácidos.O estrogênio é um hormônio de importante atividade endócrina, parácrina e autócrina, envolvido não somente na regulação da reprodução de machos e fêmeas, mas também em outras características como deposição de gordura e crescimento (Zsolnai et al., 2002). Os hormôniosestrogênios, progesterona e estradiol são importantes reguladores da gestação e parto. Diante disso, a enzima aromatase apresenta importante papel no desenvolvimento, função e regulação do ciclo reprodutivo das fêmeas. Portanto, o gene Cyp19 é considerado um candidato afetando o desempenho reprodutivo e a produção dos animais.Objetivou-se neste trabalho verificar a presença de polimorfismo do tipo SNP – Single Nucleotide Polymorphism no gene da aromatase e a freqüência alélica destas variantes em ovinos da raça Santa Inês como subsídio a futuros programas de associação com características de produção.Material e MétodosA amostra analisada consistiu de 279 animais Santa Inês, selecionados do rebanho comercial da Gaasa Agropecuária Ltda, Goiás. A propriedade é associada ao Programa de Melhoramento Genético de Caprinos e Ovinos de Corte (GENECOC) da Embrapa Caprinos e Ovinos. Nesta população 16 animais eram reprodutores, cada um com uma média de filhas (meio-irmãos) de 6,63. A manipulação e subsequente análises do DNA genômico foram realizadas no Laboratório de Biotecnologia Animal (LABTEC) da Universidade Federal de Viçosa. Primers propostos por Vanselow et al. (1999) foram usados para amplificação da região do gene Cyp19contendo o polimorfismo. Foi realizado o resequenciamento da seqüência referência depositada no GenBank (AJ012153) para confirmação do polimorfismo na população analisada. A enzima DpnII foi usada como ferramenta diagnóstico para análise de restrição do sítio no qual foi localizado uma substituição de base T>C na posição 242. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em termociclador em um volume final de 20 ul por reação. A mistura continha 5pmol de cada primer, 1,5 unidades de Taq DNA polimerase, 100 uM de cada dNTP, 2,0 mM de MgCl2, 50 mM Tris-KCl e 25 ng de DNA genômico. O programa de amplificação consistiu de desnaturação a 94ºC for 5 min, seguido por 33 ciclos de 94ºC por 1 min, 55ºC por 1 min, 70ºC por 2 min e extensão final à 72ºC por 20 min. O produto amplificado foi visualizado em gel de poliacrilamida a 8% (w/v) corado com nitrato de prata. O produto de PCR (8,0 ul) foi incubado coma enzima de restrição (5 U DpnII; Biolabs) e tampão por 3 h à 37ºC. Os fragmentos de restrição foram subsequentemente analisados em gel de poliacrilamida a 8%.Resultados e DiscussãoNa população analisada foi confirmada a presença de uma transição T>C no éxon 3, na posição 242 da seqüência AJ012151 (número de acesso GenBank) descrita por Vanselow et al. (1999). O fragmento amplificado do gene Cyp19 contêm 140 bp e o polimorfismo T242C élocalizado no códon 69. O alelo T (produto de PCR não digerido) tem um tamanho de 140 bp e o alelo C tem dois fragmentos de 82 bp e 58 bp (Figura 1). A freqüência do gene para o alelo T foi 55,91% e para o alelo C foi de 44,09%. A frequência dos genótipos foram: CC – 1,08% (3 animais), TC – 86,02% (240 animals) e TT – 12,90% (36 animais). Lôbo (2008), analisando polimorfismo neste gene em diversas raças de ovinos de corte, verificou que as freqüências alélicas foram diferentes entre raças. Vanselow et al. (1999) descreveu herança Mendeliana codominante em duas famílias da raça Merino Húngaro. Lôbo et al. (2009, em prelo) encontraram evidências de associação deste polimorfismo com características de reprodução e habilidade materna em ovinos de corte. Os autores justificaram a possibilidade de que o polimorfismo promova diferenças na atividade da enzima, resultando em diferenças no desempenho dos animais. Zsolnai et al. (2002) descreveram dois polimorfismos no gene Cyp19, um localizado no promotor 2 (P2) e o outro no intron 9 (I9). Jedrzejczak et al. (2006) não encontraram associação entre polimorfismo no gene Cyp19 e produção de leite em bovinos.Apesar de não afetar a proteína, o polimorfismo T242C pode alterar a estrutura do RNAmensageiro afetando a concentração final da proteína. Há evidências que a redução nos níveis de expressão da aromatase poderá reduzir os níveis de estrógenos.3A associação deste polimorfismo com características de importância econômica em ovinos poderá auxiliar a seleção de características produtivas e reprodutivas em ovinos. O conhecimento das freqüências alélicas para este polimorfismo facilitará na escolha daqueles animais com alelos favoráveis para as características quantitativas sob seleção.ConclusõesO presente trabalho demonstrou a presença de SNP em ovinos Santa Inês, sendo o mesmo considerado um marcador para o gene Cyp19. As informações de marcadores diretos verificados neste trabalho poderão ser usadas como ferramenta adicional para seleção de reprodutores para experimentos de associação deste e de outros polimorfismos com características de importância econômica em ovinos de corte.Literatura citadaJedrzejczak, M.; Szatkowska, I.; et al. Evaluation of associations of the polymorphism in the placenta-specific promoter 1.1 of the Cyp19 gene in Black-and-White and Jersey cattle with milk production traits. Archiv Tierzucht, Dummerstorf, v.49, p.311-314, 2006.Lôbo, A.M.B.O. Estudo genético de características de importância econômica em uma população multirracial de ovinos de corte: uma abordagem quantitativa e molecular, 2008. 96f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008.Lôbo, A.M.B.O.; Lôbo, R.N.B.; Paiva, S.R (em prelo). Aromatase Gene and Its Effects on Growth, Reproductive and Maternal Ability Traits in a Multibreed Sheep Population from Brazil. Genetics and Molecular Biology, 2009.Thompson, E.A. Jr & Siiteri, P.K. The involvement of human placental microsomal cytochrome P-450 in aromatization.  Journal of Biological Chemistry, v.249, p.5373–5378, 1974.Vanselow, J.; Zsolnai, A.; Fésus, L.; Schimidt, P.; Schwerin, M.A. Bsp143I PCR-RFLP in exon 3 of the ovine aromatase gene (CYP19), Animal Genetics, v.30, p.382-405, 1999.Zsolnai, A.; Anton, I.; Fésüs, L.; Estonba A.; Schwerin, M.; Vanselow, J. Allele distributions of two novel SNPs within the sheep Cyp19 gene,  Journal of Animal Breeding and Genetics, v.119, p.402-405, 2002.4Figura 1. Diagnóstico de fragmentos por PCR-RFLP do gene (Cyp19). Produto de PCR não digerido tem 140 pb (alelo T) e, e no caso do alelo C, são dois fragmentos, um de 82 pb e 58 pb. L = Marcador de peso molecular 100pb - Ladder (Promega®). Linha 1, 2 e 6 = TT; Linha 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25 e 26 = TC; Linha 24 = CC.

Frequência alélica do gene da aromatase (Cyp19) em ovinos Santa Inês.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/530867/1/AACFrequenciaalelica.pdf

Frequência alélica do gene da aromatase (Cyp19) em ovinos Santa Inês.

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