COSTA, M. R.

LUZ, S. de M.

POLTRONIERI, M. C.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

1 Estagiária/Embrapa Amazônia Oriental/ acadêmica do curso de Engenharia Agronômica-FCAP.2Eng. Agrônoma, M.Sc., Pesquisadora da EMBRAPA Amazônia Oriental.3 Eng. Agrônoma, M.Sc., Pesquisadora da EMBRAPA Amazônia Oriental.SIMILARIDADE GENÉTICA EM PIPERÁCEAS ATRAVÉS DE MARCADORES RAPDLUZ, Sylmara de Melo1; COSTA, Maria Rosa2; POLTRONIERI, Marli Costa3; INTRODUÇÃODentre as piperáceas nativas a espécie P. spidinervium C.DC. é a mais importante devido ao óleo essencial safrol que é umcomposto aromático empregado na indústria química. A espécie P. aduncum L. vem sendo estudada para fins medicinais.As demais piperáceas que estão em conservação no Banco de Germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental têm umobjetivo específico ligado a melhoria do sistema de produção da pimenta-do-reino sendo utilizadas como fonte deresistência ao fungo Fusarium solani f.sp.piperis, através da enxertia ou em trabalhos de melhoramento genético. Apimenta-do-reino (Piper nigrum L.) se constitui em um importante produto agrícola de consumo interno e de exportação.Apesar de oscilações de preço no mercado internacional, observa-se uma contínua tendência de aumento do seu consumo.Além disso, a cultura da pimenta  tem papel relevante no contexto sócio econômico regional, gerando divisas ao estado eempregos diretos e indiretos no meio rural.Nos Bancos de Germoplasma Vegetal, mantidos pela Embrapa Amazônia Oriental, existem pesquisas em andamento quevisam quantificar a variabilidade genética dos acessos e verificar a similaridade entre eles a fim de sanar dúvidas quanto àorigem e uso nos cruzamentos, além de auxiliar na escolha de acessos potenciais para o enriquecimento da variabilidadegenética nos próprios bancos. Tendo em vista a necessidade de conservação das Piperáceas, bem como o melhoraproveitamento destas em benefício do homem, utilizamos a biologia molecular, especificamente a técnica RAPD(Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso), como importante ferramenta na distinção e preservação desta família.O RAPD constitui-se o segundo tipo de marcador molecular mais utilizado em plantas. Ele foi desenvolvido a partir doestabelecimento da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Esta técnica possibilita a amplificação defragmentos de DNA, através da ação de uma enzima (DNA polimerase) em presença de nucleotídeos e cofatores para aatividade da mesma. Em função da grande quantidade de DNA produzida a partir do fragmento amplificado, esta amostrapode ser visualizada diretamente em gel de agarose na forma de bandas (Ferreira & Grattapaglia, 1998).Devido a essas vantagens foi escolhida a técnica de RAPD para a realização deste trabalho, como ferramenta de sumaimportância para a caracterização das Piperáceas.MATERIAIS E MÉTODOSO material analisado foi composto de 12 acessos de Piper nigrum (Bragantina, Guajarina, Cingapura-2 Brt.rx, Kottanadan,Iaçara, Perunkoide, KARK, 239, M-170, M-132, M-123 e Cingapura Baião) e hum acesso das espécies P.tuberculatum,P.attenuatum, P.spidinervium e P. aduncum provenientes do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa AmazôniaOriental, em Belém, PA. O DNA genômico foi obtido através do protocolo de Nelson (1993) modificado . A concentraçãode DNA foi estimada em gel de agarose 1,0 %, pela comparação do DNA total com três concentrações do DNA lambda. Asamostras utilizadas no RAPD, após a quantificação total, partiram de diluições da amostra total em água estéril, de modo aconter 5 ng/µl  de DNA. As alíquotas foram armazenadas a -20 0C.As reações de amplificação foram desenvolvidas de acordo com o protocolo de Williams et al. (1990) com pequenasmodificações, num volume final de 13 µl contendo água destilada autoclavada, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 2,0mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, BSA purificada (2,5 mg/ml), 1,3 uM primer arbitrário, 1U.I Taq DNA polimerase  e15 ng de DNA genômico, cobertas com duas gotas de óleo mineral.As amplificações foram realizadas em termociclador de DNA Thermolyne Amplitron II modelo DB.80225, sendorealizados 40 ciclos de 1’ a 94 0C, 1’ a 37 0C e 2’ a 72 0C, seguidos de mais 7 minutos a 72 0C para a completa extensão dosprodutos amplificados. O método utilizado para a separação dos produtos amplificados foi a eletroforese horizontal em gelde agarose 1,5 %, corado com brometo de etídio 1mg/ml. Utilizou-se 13 µl de cada reação, acrescido de 2 µl de umasolução de azul de bromofenol (40 %) mais sacarose. Foi utilizado TBE (Trizma base 0,1 M; ácido bórico 1M e EDTA0,5M) como tampão do gel e de corrida. Após a eletroforese, os géis foram visualizados e fotografados em equipamento defoto documentação por transiluminação em ultravioleta.Foi construída uma matriz para os fragmentos polimórficos amplificados com presença (1) e ausência de banda (0).Somente foram consideradas as bandas que não davam margens a dúvidas. Bandas muito fracas, de difícil resolução, nãoforam incluídas. Para análise dos dados, utilizou-se o NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate AnalysisSystem), versão 2.02. A similaridade entre as amostras foi estimada pelo coeficiente de Jaccard,  que gerou a matriz desimilaridade. A partir dessa matriz foi gerado o cluster pelo método UPGMA (“Unweighted Pair-Group Method UsingArithmetic Average”), que foi expresso na forma de um dendograma (Figura 1).RESULTADOS E DISCUSSÃOOs primers utilizados (OPT 6, 7, 8 e 12) amplificaram um total de 92 marcadores RAPD com tamanhos variando de 200 a2200 pb. Destes, 80 foram polimórficos, gerando 86,95% de polimorfismo. Segundo Dudley (1994), 75 marcadorespolimórficos são suficientes para a análise de divergência genética, uma vez que o autor considera que resultados de 50 a100 marcadores tendem a coincidir com informações baseadas no pedigree das amostras. Em média 20 fragmentospolimórficos foram gerados por primer e o número de marcadores amplificados por primer variou de 20 (OPT 08) a 26(OPT 07).Foram estimados os índices de similaridade para todos os indivíduos analisados (Tabela 1).    Tabela 01- Matriz de distância genética estimada pelo coeficiente de Jaccard para os acessos de piperáceas doBanco de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. Belém, 2002.brag guaj p.tub p.spd p.adu p.att cing kott iaca peru kark 239 m170 m132 m 123 cinbbrag 1.00guaj 0.53 1.00p.tub 0.07 0.03 1.00p.spd 0.08 0.04 0.04 1.00p.adu 0.18 0.14 0.12 0.24 1.00p.att 0.22 0.16 0.11 0.03 0.14 1.00cing 0,26 0,29 0,03 0,04 0,16 0,11 1,00kott 0.34 0.35 0.04 0.11 0.06 0.09 0.33 1.00iaca 0.25 0.18 0.12 0.07 0.19 0.15 0.25 0.14 1.00peru 0.32 0.24 0.08 0.03 0.17 0.25 0.46 0.21 0.32 1.00kark 0.35 0.23 0.10 0.12 0.21 0.33 0.17 0.14 0.28 0.39 1.00239 0.38 0.24 0.12 0.11 0.22 0.30 0.26 0.19 0.36 0.46 0.62 1.00m170 0.24 0.31 0.04 0.10 0.03 0.12 0.18 0.29 0.06 0.20 0.15 0.18 1.00m132 0.44 0.35 0.06 0.09 0.20 0.19 0.25 0.24 0.32 0.33 0.45 0.47 0.23 1.00m123 0.46 0.35 0.10 0.08 0.19 0.22 0.22 0.21 0.35 0.33 0.40 0.54 0.20 0.52 1.00cinb 0.39 0.32 0.08 0.06 0.15 0.32 0.26 0.21 0.21 0.37 0.31 0.43 0.38 0.27 0.48 1.00Coefficient0.08 0.22 0.35 0.49 0.62           Bragan.  Guajar.  KARK  239  M-132  M-123  M-170  Cing.B.(F2)  Cingapura  Perun.  Iaçara  Kottan.  P.attenuat.  P.spidiner.  P.aduncum  P.tuberc. FIGURA 1- Dendograma gerado pelo método de análise UPGMA para o coeficiente de Jaccard, a partir das 80 bandaspolimórficas geradas pelo RAPD.As maiores distâncias genéticas foram obtidas comparando-se P. tuberculatum Jacq. com Guajarina e Cingapura; P.spidinervium C.D.C. com P. attenuatum L.; M-170 com P. aduncum Linn., todos com distanciamento de 3 %. Isto indicaque estes acessos são candidatos potenciais como fonte de variabilidade no programa de hibridização, visando omelhoramento genético. Na Fig.1, encontra-se o dendograma gerado pelo método UPGMA, através do programa NTSYS-pc, 2.02. Observa-se a separação dos acessos, em dois grupos principais. No primeiro grupo, que se subdividiu em doissubgrupos, com coeficiente de similaridade, variando de 3% a 62%, incluem-se 15 materiais. Os acessos Iaçara,Kottanadan e P. attenuatum constituíram subgrupos isolados dentro de seu grupo. No segundo grupo ficou isolado o acessode P. tuberculatum que foi o mais divergente em relação ao restante dos acessos. Por outro lado a maior similaridade foiencontrada entre os acessos KARK e 239. Estes dados podem monitorar os cruzamentos com grande potencial de aumentode variabilidade no germoplasma de piperáceas.CONCLUSÃOO RAPD-PCR é uma ferramenta eficiente para detectar de maneira rápida a variabilidade genética em acessos da coleçãode germoplasma de piperáceas e possibilitou uma distinção mais precisa dentro desses grupos. O arranjo da distribuição dosacessos em função da divergência genética possibilitará monitorar os cruzamentos e incrementar o programa demelhoramento genético visando a ampliação da base genética.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASDUDLEY, J.W. Comparision of genetic distance estimators using molecular marker data. In: Analysis of MolecularMarker Data. Corvallis: Oregon, 1994, p. 3-7.FERREIRA, M.E. ; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. EmbrapaCenargen, Brasília, DF. 1996.NELSON, J. C. ITMI Wheat mapping workshop -laboratory manual. Cornell University, 1993.WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.; LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplifiedby arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.

Similaridade genética em piperáceas através de marcadores RAPD.

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