AOUADA, F. A.

FEITOSA, L.

FRACETO, L. F.

LIMA, R. de

MATTOSO, L. H. C.

MOURA, N. M. de

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Análise genotóxica de nanopartículas poliméricas de quitosana/ácido polimetacrilico com diferentes tamanhos.

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ISSN 2175-8395Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmhrapa Instrumentação AgropecuáriaMinistério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoRede de Nanotecnologia Aplicada ao AgronegócioAnais do V Workshop 2009Odílio Benedito Garrido de AssisWilson Tadeu Lopes da SilvaLuiz Henrique Capparelli MattosoEditoresEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaSão Carlos, SP2009Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Instrumentação AgropecuáriaRua XV de Novembro, 1452Caixa Postal 741CEP 13560-970 - São Carlos-SPFone: (16) 2107 2800Fax: (16) 2107 2902http://www.cnpdia.embrapa.brE-mail: sac@cnpdia.embrap.brComitê de Publicações da UnidadePresidente: Dr. Luiz Henrique Capparelli MattosoMembros: Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,Dr. João de Mendonça Naime,Dr. Washington Luiz de Barros MeloValéria de Fátima CardosoMembro Suplente: Dr. Paulo Sérgio de Paula Herrmann JuniorSupervisar editorial: Dr. Victor Bertucci NetoNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoCapa: Manoela Campos e Valentim MonzaneImagem da Capa: Imagem de AFM de nanofibra de celulose - Rubens Bemardes FilhoEditoração eletrônica: Manoela Campos e Valentim Monzaneg edição1ª impressão (2009): tiragem 200Todos os direitos reservados.A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte,constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).CIP-Brasil. Catalogação-na-publicação.Embrapa Instrumentação AgropecuáriaAnais do V Workshop da rede de nanotecnologia aplicada aoagronegócio 2009 - São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuaria, 2009.IrregularISSN: 2175-83951. Nanotecnologia - Evento.!. Assis, Odílio Benedito Garrido de.lI. Silva, Wilson Tadeu Lopes da. Ill. Mattoso, LuizHenriqueCapparelli. IV. Embrapa Instrumentação Agropecuana© Embrapa 2009Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V WorkshopANÁLISE GENOTÓXICA DE NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICASDE QUITO SANA/ÁCIDO POLIMETACRÍLICO COMDIFERENTES TAMANHOSMárcia R. de Moura", Renata de Lima', Leandro Feitosa', Fauze A. Aouada', Leonardo F. Fraceto',Luiz H. C. Mattoso''Laboratório Nacional de Nanotecnologia-Embrapa-CNPDIA São Carlos, SP,°Mregina@cnpdia.embrapa.br ;2 Departamento de Biotecnologia, Universidade de Sorocaba;3Departamento de Engenharia Ambiental, Unesp/Campus SorocabaProjeto Componente: PC4 Plano de Ação: 01.05.01.001.04.02ResumoNeste trabalho foi realizado estudo citogenético em células de linfócitos para avaliar agenotoxicidade de nanopartículas de quitosanalácido polimetacrílico (QS/PMAA) com diferentestamanhos (60 nm e 82 nm). A genotoxicidade das nanopartículas foi avaliada utilizando trêsdiferentes concentrações de nanopartículas (0,018%,0,0018%,0,00018%). Nos resultados obtidosnão foram observadas alterações morfológicas nos cromossomos das células de linfócitos. Osvalores de índice mitóticos relativos sofreram um aumento quando da exposição das células àsnanopartículas de QS/PMAA com 60 nm de tamanho, indicando que ocorreu um aumento nadivisão celular. Os testes realizados contribuem de forma positiva para avaliação da segurança dasnanopartículas de QS/PMAA.Palavras-chave: nanotecnologia, nanopartículas poliméricas, cito genética, mutagênese.IntroduçãoNos últimos anos a nanotecnologia temapresentado um grande avanço nas mais diferentesáreas do conhecimento, uma vez que estão sendodesenvolvidos vários materiais nanoestruturados(ROCO, 2003; SUH et aI., 2009). Dentre osmateriais nanoestruturados destacam-se asnanopartículas poliméricas, que são estruturas queapresentam tamanho entre 1 e 100 nm e tem sidoamplamente preparadas, para, por exemplo, carrearcompostos bioativos (fármacos, proteínas,pesticidas, nutrientes, etc). No entanto a avaliaçãodos impactos das nanopartículas aos seres vivos eambiente se faz necessária para a garantia dasegurança de sua utilização (WANG et aI., 2007).Neste trabalho foi realizada a análise citogenéticadas nanopartículas poliméricas Quitosanal Ácidopolimetacrílico (QS/PMAA) com diferentestamanhos (60 nm e 82 nm) para verificar sua possívelgenotoxicidade. Para o trabalho foram utilizadasculturas de linfócitos humanos, que foram expostas asoluções contendo nanoparticulas em trêsconcentrações distintas 0,018 %, 0,0018 % e0,00018%.Materiais e métodosSíntese e caracterização das nanoparticulas deQS/PMAAAs nanopartículas (NPs) de QS-PMAAforam preparadas por polimerização do ácidometacrílico em solução de quitosana, a partir de duasEmbrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18 de setembro de 2009207Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegocio - Anais do V Workshopetapas (MOURA et al., 2008). Na primeira etapa, aquito sana foi solubilizada em solução de ácidometacrílico por 12 horas, sob agitação magnética. Asconcentrações de quitosana utilizada na sínteseforam de 0,2; 0,5 e 0,8 (% m/v). Na segunda etapa,adicionou-se sob a solução previamente solubilizadapersulfato de potássio (K2S20g) com agitaçãomecânica. O sistema foi fechado e mantido a 70 °Cpor 1 hora, para que ocorresse a polimerização doácido metacrílico e formação das nanopartículas QS-PMAA. O tamanho médio das partículas foianalisado em um Fiber Optic Quasi Elastic LightScattering (FOQELS) (Brookhaven, USA). Asmedidas foram realizadas em triplicata à 25 "C. Assuspensões de partículas foram caracterizadasquanto à forma das partículas e homogeneidade dasuspensão, através de Microscopia Eletrônica deTransmissão (MET). O microscópio utilizado foi umPhilips Cm200.Estudo citogenéticoAs amostras de sangue periférico foramcoletadas de três indivíduos diferentes, não fumantese com hábitos regulares de alimentação. Osvoluntários realizaram a participação apósassinatura do termo de Consentimento Livre eEsclarecido (Protocolo Comitê de ética empesquisa/Universidade de Sorocaba, Protocolonúmero: 008/08).Para cada estudo, cada um dos voluntárioscontribuiu com 2,5 rnL de sangue periférico, queforam utilizados em quatro culturas diferentes,sendo utilizado para cada uma delas 500 ~L desangue. Uma das amostras serviu de controlenegativo e três outras foram utilizadas para ostratamentos com diferentes concentraçõessuspensões de QS/PMAA que resultaram emconcentração final de 0,018 %, 0,0018 % e 0,00018%, aplicadas logo no inicio da cultura. Todas asculturas foram incubadas em S mL de solução finalque consta de 78 % de meio de cultura RPMI(Culti1ab®) sup1ementado com 20 % de soro feta1bovino e 2 % de fitohemaglutinina, estas forammantidas a 37°C em incubadora com umidadecontrolada e com 5% de CO2 durante 72 h.Aproximadamente 30 minutos do períodofinal da incubação foram adicionados 15 ~L decolchicina em cada cultura, no fim do período de 72 hde incubação foi realizada a hipotonia celular comsolução de KCI 0,075M a 37 DC, por 40 mino Afixação das metáfases foi realizada utilizandomistura de metanollácido acético (3: 1, v/v). Aslaminas foram montadas e a coloração realizadautilizando o corante Giemsa, seguidamente aslaminas foram analisadas por microscopia. O índicemitótico foi determinado contando o número demetáfases pelo número total de células, o índicemitótico relativo determinado pelo índice mitóticoda concentração dividido pelo índice mitótico docontrole negativo.Resultados e discussãoCaracterização das nanopartículas de QS/PMAANa Tabela 1é apresentada à dependência entrea quantidade de quitosana na síntese e o tamanhomédio das nanopartículas. Pode ser observado queaumentando a quantidade de quitosana na síntese dasnanopartículas, o tamanho médio das NPsapresentou um decréscimo.Tabela 1. Valores de tamanho médio para asdiferentes NPs de quitosana em pH = 4,0.Nanopartícula Tamanho de partícula(nm)0,2 % m/v de QS 1l0±40,5 % m/v de QS 82 ± 20,8 % m/v de QS 60±4Todas as nanopartículas analisadasapresentam morfologia homogênea, com uniformedistribuição de tamanho de partículas e esféricosformatos, como apresentado na Figura 1.Fig. 1. Micrografias de MET das nanopartículas dequitosana preparadas com (a) 0,2; (b) 0,5 e (c) 0,8(m/v) de quitosana a pH ~ 4.Análise citogenéticaAs análises citogenéticas (qualitativas equantitativas) foram realizadas com auxílio demicroscópio e constaram de observação e contagemde células em divisão celular, foi estabelecido oíndice mitótico para cada concentração e condiçãotestada. AFigura 2 apresenta os resultados de valoresde índice mitótico determinados. Os testesmostraram que as nanopartículas de QSIPMAA deEmbrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17e 18de setembro de 2009208Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V Workshop59 nm apresentaram um aumento no valor do índicemitótico relativo, indicando que as células delinfócitos na presença destas nanopartículas sofremum aumento na divisão celular. O mesmocomportamento não foi observado para asnanopartículas de QSIPMAA com tamanho de 82nm. Cabe ressaltar ainda que as alterações nosvalores de índices mitóticos não foram concentraçãodependente, o que indica que estas modificaçõesobservadas devem-se principalmente a diferença detamanho das nanopartículas..._- -- - ---- - --- '1g II.~ I~oII ~~! w O,S1io·I1_., N ~, _J3Concentr.lç.io-----Fig. 2. Valores de índices mitóticos relativosobtidos pelas análises das células expostas asnanopartículas de QS/PMAA de diferentestamanhos (59 nm e 82 nm) e do negativo (N),(n=3).ConclusõesAs nanopartículas QS-PMAA foramsintetizadas com sucesso, através da polimerizaçãode ácido metacrílico na presença de solução dequitosana. O tamanho das partículas foi dependenteda concentração de quitosana utilizada napreparação das nanopartículas. Microscopiaseletrônicas de transmissão (MET) mostraram quenanopartículas de QS-PMAA apresentarammorfologia homogênea em forma e distribuição detamanho, com predominância da forma esférica. Osresultados obtidos neste trabalho são promissores efornecem informações sobre a genotoxicidade denanopartículas de QS/PMAA e os diferentes efeitosobservados em função das diferenças de tamanhodestas. No entanto, este estudo é restrito a um tipocelular e desta maneira, outros ensaios devem serrealizados para se obter informações adicionaissobre a segurança desta nanopartículas poliméricas,bem como seus impactos aos seres humanos eambiente.AgradecimentosFAPESP, CNPq, FINEP/MCT, EMBRAPA.ReferênciasMOURA, M. R. de.; AOUADA, F.A.; MATTOSO,L. H. C. J. Colloid Interf. Sei., [S.l.], v. 321, n. 2, p.477-483,2008.ROCO, M. C. Curr. Opino Bioteehnol., London, v.14,n.3,p.337-346,2003.SUH, W. H.; SUSLICK, K. S.; STUCKY, G. D.;SUH, Y. H. Prog. Neurobiol., Oxford, v. 87, n. 3, p.133-170,2009.WANG, J. J.; SANDERSON, B. J. S.; WANG, H.Mutat. Res., Amsterdam, v. 628, n. 2, p. 99-106,2007 .Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17e 18de setembro de 2009209

Análise genotóxica de nanopartículas poliméricas de quitosana/ácido polimetacrílico com diferentes tamanhos.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/578717/1/Proci09.00256.pdf

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