ASSIS, O. B. G. de

BERNARDES FILHO, R.

GOY, R. C.

VIEIRA, C. E. de M.

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ISSN 2175-8395Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaMinistério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoRede de Nanotecnologia Aplicada ao AgronegócioAnais do V Workshop 2009Odílio Benedito Garrido de AssisWilso Tadeu Lopes da SilvaLuiz Henrique Capparelli MattosoEditoresEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaSão Carlos, SP2009Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Instrumentação AgropecuáriaRua XV de Novembro, 1452Caixa Postal 741CEP 13560-970 - São Carlos-SPFone: (16) 2107 2800Fax: (16) 2107 2902http://www.cnpdia.embrapa.brE-mail: sac@cnpdia.embrap.brComitê de Publicações da UnidadePresidente: Dr. Luiz Henrique Capparelli MattosoMembros: Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,Dr. João de Mendonça Nairne,Dr. Washington Luiz de Barros MeioValéria de Fátima CardosoMembro Suplente: Dr. Paulo Sérgio de Paula Herrmann JuniorSupervisor editorial: Dr. Victor Bertucci NetoNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoCapa: Manoela Campos e Valentim MonzaneImagem da Capa: Imagem de AFM de nanofibra de celulose - Rubens Bemardes FilhoEditoração eletrônica: Manoela Campos e Valentim Monzane1ª ediçãolª impressão (2009): tiragem 200. :rodos 0& direitos reservados,A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte.constitui iolação dos direitos autorais (Lei no 9.6 lO).CIP-Brasil. Catalogação-na-publicação.Embrapa Instrurneatação Agropecuária---------_._-_._--------Anais do V Workshop da rede de nanotecnoJogia aplicada aoagronegócio 2009 - São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuaria, 2009.IrregularISSN: 2175-83951. Nanotecnologia - Evento. 1. Assis, Odílio Benedito Garrido de.Il, Silva, Wilson Tadeu Lopes da. Ill. Mattoso, Luiz HenriqueCapparelli. IV. Embrapa Instrumentação Agropecuaria .© Embrapa 2009Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V WorkshopAVALIAÇÃO PRELIMINAR DA INTERAÇÃOBACTERIA/FILMES DERIVADOS DE QUITO SANAPOR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICARejane Celi Goy, Carlos Eduardo de Moraes Vieira, Rubens Bernardes Filho, Odilio B.G AssisProjeto Componente: PC3Embrapa Instrumentação Agropecuária São Carlos, SP; odilio@cnpdia.embrapa.brPlano de Ação: 01.05.1.01.03.03ResumoFilmes de quito sana e N,N,N-trimetilquitosana foram produzidos por "casting" sobre lâmina devidro na concentração de 2g1L e as superficies analisadas por microscopia de força atômica. Sobreos filmes foram depositadas bactérias gram-negativa (E. coZi) na concentração aproximada deZxlO" organismos/mL e imagens da interação bactérialsuperficies foram obtidas para observar ocomportamento resultante.Palavras-chave: quito sana, trimetilquitosana, Ecoli, microscopia de força atômica.IntroduçãoQuitosana e seus derivados são materiaisconhecidos por sua capacidade de inibição de umgrande número de espécies de bactérias e fungoscom comprovada eficiência, mesmo em baixasconcentrações (SHARlDI et aI., 1999; SIMPSON etaI., 1997). Quitosanas comerciais, não modificadas,têm sido amplamente empregadas em produtosagrícolas como revestimento protetor com o objetivode impedir a expansão de fungos, principalmenteàqueles que se desenvolvem na condição pós-colheita (ASSIS, 2008). Sua maior aplicação se dá naforma de filmes ou coberturas, que além de sua açãoantimicrobiana atua no controle das mudançasfisiológicas e morfológicas reduzindo o tempo dematuração e elevando a vida de prateleira (SHARIDIet aI., 1999; ASSIS e PESSOA, 2004; ASSIS et aI.,2008). Essas propriedades funcionais da quitosanapodem ser melhoradas quando combinados comdemais materiais ou agentes ativos (DUTTA et aI.,2009). Filmes de quitosana são normalmente obtidospor "casting" a partir de diferentes soluções ácidas ediversas caracterizações têm sido conduzidas,principalmente quanto às suas propriedadesmecânicas e reológicas (BéGIN e CALSTEREN,1999; BRlTTO et aI., 2005). Com respeito aatividade antimicrobiana, o material na forma defilme, em função da distribuição espacial dascadeias, provavelmente possui impedimentoespacial que dificulta uma efetiva interação entre ossítios ativos da quitosana e as membranas celularesdos microorganismos, o que, em princípio,diminuiria a eficiência antimicrobiana. Essadeficiência pode ser superada por um aumento naconcentração de cargas na cadeia polimérica,elevando assim o número de sítios aptos para ainteração. Esse efeito pode ser conseguido com amodificação da quitosana, por reações dequatemização, que incorporam cargas positivaspermanentes junto aos grupos aminos, como oscompostos de N ,N,N-trimetilqui tosana (TMQ).Estudos recentes com sais quatemários dequitosana têm confirmado a superior atividadedesses derivados com relação à quitosana de partida(SADEGHI et aI., 2008). Em avaliação preliminartambém realizada pela Embrapa a superioridade daatividade antimicrobiana da TMQ foi confirmada eEmbrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18 de setembro de 200998Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V Workshopem estudos com E. coli em meio aquoso(CARVALHO et al., 2007). Neste trabalhoavaliamos por microscopia de força atômica (AFM)as alterações e características superficiais de filmesde quitosana e de seus sais quaternizados apósinteração com culturas de bactérias E.colí.Materiais e métodosOs filmes e o derivado quaternizado foramprocessados a partir de quitosana comercial daAldrich, de médio peso molecular. A quaternizaçãofoi conseguida por reação com dimetilsulfato,segundo seqüência apresentada anteriormente(BRITTO e ASSIS, 2007). Os filmes avaliadosforam preparados por "casting" sob superficie devidro a partir de géis precursores na concentração de2,Og/L. Para formulação com quitosana comercial osolvente foi ácido acético a 1% e para o derivadoquaternário foi empregada água deionizada em pH 7.Os filmes ficaram acondicionados em dessecador atéa total evaporação do solvente.A interação com meio de E.coli se deu pelaimersão dos filmes em solução com culturas, naconcentração de 2xl08 microorganismos/rnL. Apóssecagem as superficies foram varridas em sistemaAFM (Veeco Dimension V). O objetivo éinvestigatório procurando comparar ou identificaralterações nas topografias resultantes da interaçãodas bactérias com a quitosana comercial e com ocomposto quaternizado.Resultados e discussãoPelas imagens e pela análise dos dadosgerados na Tabela 1, pode-se observarprimeiramente, a diferença entre os filmes dequitosana e de TMQ pelas variações na altura média(Z) e na rugosidade. Quitosana, de um modo geral,forma filmes muito finos e uniformes, já a TMQapresenta uma topografia mais irregular com maiorrugosidade. Uma possível causa para este aspecto é aalta concentração de água no polímero, o que gerauma taxa de cura do filme mais lenta edesproporcional entre as diferentes espessuras,formando topografia irregular na condição seca.Associado a esta característica salientar a presençade uma maior densidade de cargas superficiais(grupos NH2 protonados), que faz com que ocorrauma "repulsão" entre as cadeias que podem levar aformação de filmes menos densos e de espessurasirregulares, este aspecto é depreendido pelasmedidas de rugosidade.Quando temos a presença de bactérias nasuperficie observamos para ambos os materiais umcomportamento semelhante em relação à alturamédia e rugosidade (Tabela 1)mostrando que nessescasos a medida topográfica fica sendo governadapelas bactérias adsorvidas.Tabela 1. Valores de altura média (Z) e rugosidadepara os filmes de quitosana e TMQ com e sembactérias adsorvidas.Filmes Z(um)Rugosidade(um)Quitosana 13 1,92TMQ 140 15,0Quitosana + E. coli 780 103,0TMQ + E. coli 750 119,4(a)(b) 1.181Jtn-1.04 um(c)0.78 um0.01 um(d) 0,49 pm-0,26 pmFig. 1. Imagens de AFM (a) quitosana; (b)quitosana + E.coli; (c) TMQ; (d) TMQ + E.coli.Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17e 18 de setembro de 200999Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegôcio - Anais do V WorkshopEmbora não seja passível de contagem,aparentemente há uma maior concentração debactérias aderidas ao filme de quito sana do que asencontradas na superfície de TMQ. Duasobservações cabem a este comportamento: i)segundo dados da literatura (MORAIS et al., 2009), aaderência de bactérias gram-negativas é maior emsuperficies mais hidrofóbicas e neste caso a TMQ éconsideravelmente mais hidrofllica que a quitosana eii) segundo análises realizadas por Silva Jr e Teschke(2005), baseadas em imagens por AFM de E.coliimobilizadas sobre mica (um suporte altamentehidrofllico), observou-se que após a interação eruptura da membrana bacteriana, a capacidade deaderência desses microorganismos sãoconsideravelmente reduzidas, o que interfere emuma amostragem visual. As analises realizadas até omomento parecem confirmar esses resultadosindicando, em principio, uma maior atividade daTMQ.ConclusõesEmbora ainda não conclusivas, as imagensgeradas por AFM da interação fllmeslbactériasindicam uma maior aderência de microorganismossobre o filme de quitosana do que a observada para ofilme de TMQ. Diversos efeitos podem levar a essecomportamento, sendo a hidrofilicidade e adensidade de carga e, consequentemente acapacidade de hidrólise, parâmetros que devem serconsiderados.AgradecimentosFapesp, EMBRAPA, CNPq, FINEP/MCT.ReferênciasASSIS, O. B.G Rev. Iber. Tecnología Postcosecha,[S.l.], v. 9, n. 2, p. 148-152,2008.ASSIS, O. B. G; FORATO, L. A; BRITTO, D.Higiene Alimentar, São Paulo, v. 22, p. 99-106,2008.ASSIS, O. B. G; PESSOA, J. D. C. Brazilian J.Food Techn., [S. l.], v. 7, n. 1, p. 17-22,2004.BÉGIN, A; CALSTEREN, M.-R. V. Int. J.Biological Macromolecules, Guildford, v. 26, p.63-67, 1999.BRITTO, D.; ASSIS, O. B. G CarbohydratePolymers, Barking, v. 69, p. 305-310,2007.CARVALHO, C. R.; BRITTO, D.; ASSIS, O. B. GEstudo da Ação Inibidora do Derivado N,N,N-Trimetilquitosana na Cinética de Crescimento daE. Coli. In: SIMPÓSIO EM MICROBIOLOGIAAPLICADA, 3., 2007, Rio Claro, SP. Livro deResumos ... Rio Claro: UNESP, 2007. v. único. p.18.DUTTA, P. K.; TRIPATHI, S.; MEHROTRA, GK., DUTTA, 1. Food Chemistry, London, v. 114,p. 11731182,2009.MORAIS, L. C.; BERNARDES-FILHO, R.;ASSIS, O. B. G World J. Microbiol. Biotechnol.,Oxford, v. 25, p. 123-129,2009.SADEGHI, A. M. M.; AMINI, M.; AVADI, M. R.,SIEDI, F.; RAFIEE-TEHRANI, M.; JUNGINGER,H. E. J. of Bioactive and Compatible Polymers,[S.!.], v. 23, p. 262-275, 2008.SHARIDI, F.; ARACHCHI, 1. K. V; JEON, Y.-1.Trends in Food Sci. & Technol., [S.!.], v. 10, p.37-51,1999.SILVA JR, A; TESCHKE, O. World J. MicrobiolBiotechnol., Oxford, v. 21, p. 11031110,2005.SIMPSON, B. K.; GAGNE, N.; ASHIE, I. N. A.NOROOZI, E. Food Biotechnol., NewYork, v. 11,p. 25-44, 1997.Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18de setembro de 2009100

Avaliação preliminar da interação bactéria/filmes derivados de quitosana por microscopia de força atômica.

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