BOREM, A.

FERREIRA, J. L.

FRITSCHE-NETO, R.

LANES, E. C. M. de

MIRANDA, G. V.

SANT'ANA, G. C.

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7º Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas138Análise da Diversidade Genética Entre Acessos de Milho Tolerantes a Baixos Níveis de Nitrogênio e Fósforo Utilizando Marcadores Moleculares MicrossatélitesGustavo César Sant´Ana1, Eder Christian Malta de Lanes2, Glauco V. Miranda3, Juliano Lino Ferreira4 Aluizio Borem5, Roberto Fritsche-Neto6Resumo2GHVHQYROYLPHQWRGHFXOWLYDUHVDGDSWDGDVjVFRQGLo}HVGHHVWUHVVHFDXVDGRSRUEDL[RVQtYHLVGH1e P apresenta-se como uma opção economicamente viável e ecologicamente sustentável para garantir maior produtividade em sistemas agrícolas com baixa utilização de insumos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diversidade genética entre 14 acessos de milho, sendo 7 tolerantes a baixos níveis de nitrogênio e 7 tolerantes a baixos níveis de fósforo. Foi observado um total de 299 alelos, com o número de alelos por loco variando de 1 a 8, com uma média de 3,6875. Todos os acessos se mostraram homozigotos em relação a todos os locos analisados. A matriz de dissimilaridade genética evidenciou a existência de um razoável nível de variabilidade genética entre as linhagens. A dissimilaridade genética variou de 0,3551 (entre 7 e 8) a 0,6885 (entre 1 e 7) com média igual a 0,5424. A análise de agrupamento evidenciou a formação de 3 grupos, um constituído por duas linhagens tolerantes a baixos níveis de N (11 e 12), o segundo formado por 4 linhagens tolerantes a baixos níveis de P (3, 5, 6 e 7) e duas a baixos níveis de N (8 e13) e o terceiro formado por 3 linhagens tolerantes a baixos níveis de P (1, 2 e 4) e 3 a baixos níveis de N (9, 10 e 14). Os resultados obtidos no presente trabalho podem ser úteis para o planejamento de cruzamentos entre genitores com níveis desejados de divergência genética, no sentido de contribuir para o melhoramento simultâneo para tolerância a baixos níveis de N e a baixos níveis de P.IntroduçãoO desenvolvimento de variedades de milho tolerantes a diversos tipos de estresses abióticos é importante para a ampliação da produção e das áreas de cultivo desse importante cereal. Entre os diversos tipos de HVWUHVVHVDELyWLFRVDGH¿FLrQFLDGHQLWURJrQLR1HGHIyVIRUR3VmRFRPXQVQRVVRORVEUDVLOHLURVDIHWDQGRnegativamente o desenvolvimento das plantas e levando a redução da produtividade. O desenvolvimento GHFXOWLYDUHVDGDSWDGDVjVFRQGLo}HVGHHVWUHVVHFDXVDGRSRUEDL[RVQtYHLVGH1H3DSUHVHQWDVHFRPRXPDopção economicamente viável e ecologicamente sustentável para garantir maior produtividade em sistemas agrícolas com baixa utilização de insumos (SOUZA et al 2008).O fósforo é um nutriente limitante em várias regiões do mundo, principalmente em solos intemperizados dos trópicos. Quando a disponibilidade desse nutriente no solo é baixa, ocorre redução do metabolismo, da massa e da superfície de vários órgãos das plantas, afetando sua produtividade. Isso se deve ao fato de que o fósforo está envolvido na produção e transporte de energia, fotossíntese, transformação de carboidratos e na composição de ácidos nucléicos , carboidratos fosfatados, fosfolipídios e coenzimas). Já o nitrogênio é FRQVWLWXLQWHGHSURWHtQDVFRHQ]LPDViFLGRVQXFOpLFRV¿WRFURPRV$73$GHQRVLQD7ULIRVIDWRFORUR¿ODHLQ~PHUDVHQ]LPDV-$.(/$,7,6HWDOLQÀXHQFLDQGRRFUHVFLPHQWRGDSODQWDPDLVGRTXHTXDOTXHUoutro nutriente (MUNDSTOCK 2000). O conhecimento das relações de parentesco e da diversidade genética entre os genótipos a serem melhorados contribui para a organização do germoplasma disponível e para a proteção de cultivares (Melchinger et al 1991; Bernardo 2002). Em relação a organização do germoplasma, os genótipos podem ser agrupados de acordo com a similaridade genética estimada e distribuídos em grupos heteróticos. Para a proteção de FXOWLYDUHV LQIRUPDo}HV VREUHDGLVWkQFLDJHQpWLFDHQWUHDFHVVRV VmR LPSRUWDQWHVSDUDD LGHQWL¿FDomRGHderivação essencial e para a proteção legal do germoplasma (Smith et al 1995). Portanto, informações a respeito da diversidade genética entre materiais elite a serem utilizados como genitores é de fundamental importância para o melhoramento (Hallauer e Miranda 1988).1 Doutorando em Genética e Melhoramento –UFV. E-mail:gcsant@yahoo.com.br2  Doutorando em Genética e Melhoramento –UFV. E-mail:  edercml@yahoo.com.br3 Professor da UFV. E-mail: glaucovmiranda@ufv.br4 Pesquisador da EMBRAPA Pecuária Sul. E-mail:  julianolf@yahoo.com.br5 Professor da UFV. E-mail: borem@ufv.br6 Professor da ESALQ/USP. E-mail: rfritscheneto@gmail.com7º Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas139Diversos tipos de marcadores moleculares vêm sendo amplamente utilizado em estudos de diversidade e estrutura genética de populações de plantas. Os marcadores microssatélites têm sido um dos mais utilizados SDUD HVVDV¿QDOLGDGHV SRU DSUHVHQWDU FDUDFWHUtVWLFDVGHVHMiYHLV WDLV FRPRFRGRPLQkQFLDPXOWLDOHOLVPRHHOHYDGRJUDXGHSROLPRU¿VPR6DQWDQDHWDO2REMHWLYRGHVVHWUDEDOKRIRLDYDOLDUDGLYHUVLGDGHgenética entre 14 acessos de milho, sendo 7 tolerantes a baixos níveis de nitrogênio e 7 tolerantes a baixos níveis de fósforo.Materiais e MétodosNesse experimento foram utilizadas duas fontes de germoplasma do milho: a primeira composta por sete OLQKDJHQVKRPRJrQHDVHH¿FLHQWHVSDUDRXVRGRIyVIRURHFRQWUDVWDQWHVSDUDRXVRGRQLWURJrQLR*UXSRHDVHJXQGDFRPSRVWDSRUOLQKDJHQVH¿FLHQWHVHKRPRJrQLDVSDUDRXVRGRQLWURJrQLRHFRQWUDVWDQWHVpara o uso do fósforo (Grupo 2). As linhagens e os híbridos que as deram origem estão listados na tabela 1. Tabela 1 – Linhagens utilizadas, tolerância, híbridos que as deram origem e empresas produtoras.Linhagens Tolerância Híbrido Empresa1 Baixo P AGN 34M11 Agromen2 Baixo P P3041 Pionner3 Baixo P DKB350 Dekalb4 Baixo P P3041 Pionner5 Baixo P DKB435 Monsanto6 Baixo P Syngenta Forte Syngenta7 Baixo P XB8028 Semeali8 Baixo N AG 8080 Agroceres9 Baixo N P3041 Pionner10 Baixo N P30A00 Pionner11 Baixo N Syngenta Garra Syngenta12 Baixo N Balu 551 Balu13 Baixo N Balu 184 Balu14 Baixo N P30F88 PionnerAmostras de tecidos foliares jovens foram coletadas em cada linhagem e utilizadas para a extração de DNA. O DNA foi extraído de acordo com o método descrito por Doyle e Doyle (1990). Os 80 marcadores SSR utilizados foram selecionados com base nas unidades de repetição e locais no “Bin” para fornecer uma cobertura ampla e uniforme do genoma do milho. As sequências dos marcadores foram obtidas no Banco de 'DGRVGH*HQpWLFDH*HQ{PLFDGR0LOKR±0DL]H*'%KWWSZZZPDL]HJGERUJVVUSKS$DPSOL¿FDomRSRU3&5IRUDPUHDOL]DGDVQXPYROXPHGH/HRSURGXWRGDDPSOL¿FDomRIRLVXEPHWLGRjHOHWURIRUHVHem gel de poliacrilamida 6%.$SDUWLU GRV SHU¿V DOpOLFRV JHUDGRV FRPRV PDUFDGRUHVPLFURVVDWpOLWHV SDUD DV  OLQKDJHQV IRLconstruída uma matriz, na qual cada alelo de cada loco foi designado numericamente de 1 até o número máximo de alelos no locus. Utilizando o aplicativo computacional “Genealex 6” (Peakall e Smouse, 2006) foi estimada a Probabilidade o Identidade (para cada locus e acumulada). Por meio do aplicativo “Convert” foi estimada a frequência alélica para todos os loci individualmente. Este software foi também utilizado para converter a matriz dos dados para o formato de outros aplicativos . O PopGene32 foi utilizado para calcular o número de alelos por loco; a heterozigosidade esperada e a heterozigosidade observada . O cálculo GRVYDORUHVGHFRQWH~GRGHLQIRUPDomRSROLPyU¿FD3,&DPDWUL]GHGLVVLPLODULGDGHJHQpWLFDEDVHDGDQDGLVWkQFLD³&6&KRUG´&DYDOOL6IRU]DH(GZDUGVHXPDiUYRUH¿ORJHQpWLFDREWLGDSHORPpWRGRGHagrupamento do vizinho mais próximo foram feitos utilizando o programa “Powermarker Version 3.25”. 7º Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas140Resultados e DiscussãoOs 80 marcadores microssatélites utilizados nesse trabalho permitiram a diferenciação dos 14 acessos de milho analisados. Considerando os 80 locos nas 14 linhagens, foi observado um total de299 alelos, com o número de alelos por loco variando de 1 a 8, com uma média de 3,6875. Todos os acessos se mostraram homozigotos em relação a todos os locos analisados, o que era esperado, uma vez que se trata de linhagens endogâmicas. A matriz de dissimilaridade genética baseada no índice C.S.Chord evidenciou a existência de um razoável nível de variabilidade genética entre as linhagens. A dissimilaridade genética variou de 0,3551 (entre 7 e 8) a 0,6885 (entre 1 e 7) com media igual a 0,5424.O dendrograma gerado pelo método do vizinho mais próximo (FIGURA 1) evidenciou a formação de 3 grupos. O primeiro grupo é constituído por duas linhagens tolerantes a baixos níveis de Nitrogênio (11 e 12). O segundo grupo é formado por 4 linhagens tolerantes a baixos níveis de P (3, 5, 6 e 7) e duas a baixos níveis de N (8 e13). O terceiro grupo mostrou-se dividido em dois subgrupos, um formado por 3 linhagens tolerantes a baixos níveis de P (1, 2 e 4) e outro formado por 3 linhagens tolerantes a baixos níveis de N (9, 10 e 14). Figura 1 - Dendrograma gerado pelo método do vizinho mais próximo. As linhagens 1 a 7 são tolerantes a baixos níveis de P e as linhagens 8 a 14, a baixos níveis de N.$FDSDFLGDGHHVSHFt¿FDGHFRPELQDomRGHOLQKDJHQVHQGRJkPLFDVGHPLOKRHPWUDEDOKRUHDOL]DGRSRUBetran et al. (2003), avaliada em estresses de nitrogênio, foi negativa para híbridos, envolvendo linhagens endogâmicas originadas do mesmo germoplasma, e positiva e elevada para linhagens oriundas de fontes diferentes, demonstrando a importância da adoção de critérios que permitam a discriminação dos genitores, formando grupos divergentes para a extração de linhagens. Portanto, os resultados obtidos no presente trabalho podem ser úteis para o planejamento de cruzamentos entre genitores com níveis desejados de divergência genética, no sentido de contribuir para o melhoramento simultâneo para tolerância a baixos níveis de N e a baixos níveis de P.7º Congresso Brasileiro de Melhoramento de Plantas141AgradecimentosOs autores do presente trabalho agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível 6XSHULRU±&$3(6HDR&RQVHOKR1DFLRQDOGH'HVHQYROYLPHQWR&LHQWt¿FRH7HFQROyJLFR±&13TSHODFRQFHVVmRGDVEROVDGHHVWXGRGHGRXWRUDGRHSHOR¿QDQFLDPHQWRGDSHVTXLVD5HIHUrQFLDV%LEOLRJUl¿FDVBetran FJ et al (2003) Genetic  analysis of inbred and hybrid grain yield under stress and nonstress environments in tropical maize. Crop Science, 43:807–817.Bernardo R (2002) Breeding for quantitative traits in plants. Stemma Press, Woodbury, p 41, p 249Bredemeier C and Mundstock C. Regulação da absorção e assimilação do nitrogênio nas plantas. Ciência Rural, v. 30, n. 02, p. 365-372, 2000.Doyle JJ and Doyle JL.(1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 1315.Evanno G et al (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology. 14: 2611-2620. Hallauer AR and Miranda JBF (1988) Quantitative genetics in maize breeding, 2nd edn. Iowa State University Press, AmesJakelaitis A et al (2005) Efeitos do nitrogênio sobre o milho cultivado em consórcio com Brachiaria brizantha. Acta Scientiarum Agronomy, 27: 39-46.Melchinger AE et al (1991) Diversity and relationships among U.S. maize inbreds revealed by restriction fragment length polymorphisms. Crop Science 31:669–678Sant’ana GC et al (2012) Comparison of a retrotransposon-based marker with microsatellite markers for discriminating accessions of Vitis vinifera. Genetics and Molecular Research 11: 1507-1525 6PLWK-6&HWDO,GHQWL¿FDWLRQRIPDL]HYDULHWLHV,Q:ULJOH\&:HG,GHQWL¿FDWLRQRIIRRGJUDLQvarieties. America Associated of Cereal Chemists, St Paul, pp 253–2646RX]D/9HWDO*HQHWLFFRQWURORIJUDLQ\LHOGDQGQLWURJHQXVHHI¿FLHQF\LQWURSLFDOPDL]HPesquisa Agropecuária Brasileira. 43:1517-1523.

Análise da diversidade genética entre acessos de milho tolerantes a baixos níveis de nitrogênio e fósforo utilizando marcadores moleculares microssatélites.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/964213/1/Ferreiracbmp138.pdf

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