ASSIS, O. B. G. de

BRITTO, D. de

SELEGHIM, M. H. R.

SILVA. L. P. da

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Determinação da mínima concentração inibitória (MIC) de derivados hidrossolúveis de quitosana contra E. COLI.

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ISSN 2175-8395Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaMinistério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoRede de Nanotecnologia Aplicada ao AgronegócioAnais do V Workshop 2009Odílio Benedito Garrido de AssisWilson Tadeu Lopes da SilvaLuiz Henrique Capparelli MattosoEditoresEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaSão Carlos, SP2009Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Instrumentação AgropecuáriaRua XV de Novembro. 1452Caixa Postal 741CEP 13560-970 - São Carlos··SPFone: (16) 21072800Fax: (16) 2107 2902http://www.cnpdia.embrapa.brE-mail: sac@cnpdia.embrap.brComitê de Publicações da UnidadePresidente: Dr, Luiz Henrique Capparelli MattosoMembros: Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,Dr. João de Mendonça Naime,Dr. Washington Luiz de Barros MeioValéria de Fátima CardosoMembro Suplente: Dr, Paulo Sérgio de Paula Herrmann JuniorSupervisor editorial: Dr. Victor Bertucci NetoNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoCapa: Manoela Campos e Valentim MonzaneImagem da Capa: lmagem de AFM de nanofibra de celulose - Rubens Bemardes FilhoEditoração eletrônica: Manoela Campos e Valentim Monzane1ª edição1ª impressão (2009): tiragem 200Todos os direitos reservados.A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte,constitui violação dos direitos autorais (Lei nO 9.610).CIP-BrasiJ. Catalogação-na-publicação.Embrapa Instrurnentação AgropecuáriaAnais do V Workshop da rede de nanotecnologia aplicada aoagronegócio 2009 - São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuaria, 2009.IrregularISSN: 2175-83951. Nanotecnologia - Evento. 1. Assis, Odílio Benedito Garrido de.lI. Silva, Wilson Tadeu Lopes da. Ill. Mattoso, Luiz HenriqueCapparelli. IV. Embrapa Instrumentação Agropecuaria© Embrapa 2009Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V WorkshopRedegfO _W~"~ NonoDETERMINAÇÃO DA MINIMA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA (MIe)DE DERIVADOS HIDROSSOLÚVEIS DE QUITO SANACONTRA E. COL!Leandro Prezotto da Silva':', Mirna Helena Regali Seleghírn", Douglas de Britto', Odilio B.G Assis''Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, SP. Odilio@cnpdia.embrapa.br2Universidade Federal de São Carlos - UFSCarProjeto Componente: PC2 Plano de Ação: O l.05.l.0 l.02.02Resumoo efeito antibacteriano do derivado trimetilado de quitosana (TMQ) foi avaliado contra a bactériaEscherichia coli. O derivado foi preparado via reação com dimetilsulfato a partir de quito sana deorigem comercial. A mínima concentração inibitória (MIC) foi medida em meio agar através demedidas de mudança na turbidez e por contagem em placas (Colony Forming Units - CFU). Osresultados indicam boa atividade antimicrobiana com MIC nos intervalos de 0,0075 gL"1 a0.0035 gL"I. O objetivo é o emprego desses compostos como revestimentos comestíveis ou naprodução de embalagens ativas.Palavras-chave: derivados de quitosana, atividade antimicrobiana, MIe.IntroduçãoQuitosana é um polissacarídeo catiônico queocorre naturalmente ou pode ser obtido por reaçãoalcalina da quitina, um abundante subproduto daindústria pesqueira. Por suas características atóxicase de fácil formação de filmes, a quitosana tem sidoestudada em potenciais aplicações em alimentos,agricultura e medicina (KUMAR, 2000).Quando submetido a processo de metilação, aquitosana é transformada em um derivadotrimetilado (TMQ) caracterizado por ter cargaspositivas permanentemente em conseqüência daquatemização dos grupos aminos na posição C2 daestrutura polimérica (CURTI e CAMPANA-FILHO,2003). A TMQ pode ser sintetizada tanto pela adiçãocovalente de um substituinte contento um grupoamônio quatemário via quatemização dos gruposaminos ou como demonstrado recentemente pelouso de dimetilsulfato como agente metilante(BRITTO eASSIS, 2007). A TMQ é solúvel em umaampla faixa de pHs e sua atividade antimicrobianatem sido registrada como superior à quitosanaprecursora (lIA et al., 2001), na qual o comprimentoda cadeia n-alkil revelou-se ser um importanteaspecto dessa atividade (QIN et al., 2004). A TMQ,assim como a quitosana tem a habilidade de formarfilmes finos e é um potencial material para uso emalimentos, em particular para emprego emrevestimentos protetores pós-colheita e filmes paraembalagens. O objetivo do presente estudo édeterminar o MIC para a TMQ contra E. colisintetizada via reação com dimetilsulfato.Materiais e métodosQuitosana da Sigma Aldrich (média massamolar) foi empregada como material inicial para aobtenção da TMQ. A reação de metilação foiconduzida a 70°C com dimetilsulfato da Vetec. Areação básica e proporção de reagentes estãodescritas em Britto e Assis (2007). A atividadeantimicrobiana do derivado meti lado foi examinadacontar a bactéria modelo Oram-negativaEscherichia coli (ATCC 8739). Para tal,inicialmente uma mistura de 7,5 ml de cultura deEmbrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18 de setembro de 200947Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V Workshopbactéria foi transferida para erlenrneiers (500 mL)contendo 142,5 ml de meio sintético (E agar). A pré-cultura de E. coli foi incubada a 37°C sobanaerobiose e agitação moderada. O efeito inibitóriofoi determinado pela alteração de turbidez e porcontagem de colônia (CFU). Medidas deabsorbância foram realizadas a cada 30 min emcOmprimento de onda de 600 nrn (Novaspec lI). Paraa contagem de colônia em meio sólido foi empregadao Drop Count Method.Resultados e discussãoA Figura 1 apresenta o perfil de absorbânciapara o meio de cultura com e sem TMQ. E possívelobservar indiretamente o correspondente número decélulas crescidas ao longo do tempo indicando umcomportamento exponencial durante as primeiras 5hrs uma taxa constante entre 6 e 7 hs (para o meiosem derivado).Nos meios com adição TMQ oscomportamentos são similares embora com aredução da fase Log e um declínio nos valores deabsorbância com o tempo (fase de mortalidadecelular). A adiçaõ de TMQ na concentração de0,0035 gL'I, apresenta pouco efeito inibitório, comcomportamento próximo ao controle. Pelos ensaiosde turbidez a melhor inibição a crescimento da E.coli se dá em adições de TMQ entre 0,02 e 0,0075 gl,:I, sendo essas c concentrações próximas à registradaspara oligossacarídeos de quito sana contra E. colinos experimentos realizados por Jeon et al. (2001).0,40,3W 0,38 0,2<Oci 0,2º-~ 0,10,10,00,0O-o-no TMCh-.- 0.02 g/L TMCh added- .••- 0.0075 g/L TMCh added-*- 0.0035 g/L TMCh added/~2 3 4 5 6 7Time (hr)Fig. 1. Perfil de crescimento da E. coli (medida deturbidez em 600 nmI 37° C)Considerando que cada colônia crescida emmeio nutriente sólido resulta em uma única bactéria,a medida paralela do crescimento por mL pode serdiretamente relacionada com a absorbância. Para osmateriais avaliados, (Fig. 2), a concentração de TMQno intervalo de 0,02 a 0,0035 gL'1 resulta em umrelativo aumento da atividade antimicrobiana comproporcional redução não apenas do número total decolônias macroscopicamente visíveis como tambémda fase estacionária.-0- no TMCh-.- 0.02 g/L TMCh added80 - .••- 0.0075 g/L TMCh added-*- 0.0035 g/L TMch added70 •*6050~b 403020102 3 5 6 7 84Time (hr)Fig. 2. Perfil em função do tempo de incubação daanálise da população de E.coli em meio de culturana presença de TMQ.Com o objetivo de quantificar essa reduçãoestabelecendo um fator numérico as curves deabsorbância foram derivadas em função do tempopara a identificação de seus crescimentos máximospara cada concentração de TMQ, ou seja:8O emprego desta relação indica que umaredução em aproximadamente 50% sobre ocrescimento para concentrações de TMQ de 0,02 g/Le um pequeno efeito inibitório, de apenas 2%, para aconcentração de 0,0075 glL. Na cultura com 0,0035g/L de TMQ um aumento no crescimento bacterianoao redor de 57% com relação ao meio controle éobservado, o que pode ser explicado como essaadição sendo convertida em nutriente, favorecendoassim o crescimento da E. coli. De uma forma geral,altas concentrações de quitosana não apresentamatividade antimicrobiana, por razões diversasconforme revisadas por Goy et al. (2009).ConclusõesDerivados trimetilados de quitosana TMQapresentaram ter importante ação inibitória contrabactéria Gram-negativa conforme testes conduzidosna bactéria E. coli. Os resultados indicam que aaparente mínima concentração inibitória estápróxima a 0,002 gL'I. de materiais ativos para uso emembalagens ou revestimentos protetores pós-colheita.Embrapa Instrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18 de setembro de 200948Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V WorkshopAgradecimentosCNPq, FINEP/MCT, EMBRAPA.ReferênciasBRITTO, D.; ASSIS, O. B. G. CarbohydratePolymers, Barking, v. 69, p. 305-310,2007.CURTI, E.; BRITTO, D.; CAMPANA-FILHO, S.P.Macromolecular Bioscience, Weinheim, v. 3, n. 10,p. 571-576, 2003.GOY, R. c., BRITTO, D.; ASSIS, O. B. G.Polímeros, 2009. aceito.JIA, Z.; SHEN, D.; XU, W. CarbohydrateResearch,Amsterdam, v. 33,p. 1-6,200l.QIN, C.; XIAO, Q.; FANG, H. M.; LIU, Y.; CHEN,x., LI, Q. Intern. J. ofBiological Macromolecules,Guildford, v. 34, n. 2, p. 121-126,2004.KUMAR, M. N. V. R. Reactive and FunctionalPolymers, [S.l.], v. 46, p. 1-27,2000.JEON Y-J.; PARK P-J.; KIM S-K. CarbohydratePolymers, Barking, v. 44, p. 71-76,2001.Embrapa lnstrumentação Agropecuária, São Carlos, 17 e 18 de setembro de 200949

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