O objetivo deste trabalho foi o de contribuir no estudo da estabilidade do transgene e sua herança através de várias gerações dos cruzamentos e retrocruzamentos em diferente germoplasma de feijoeiro comum com a linhagem Olathe 5.1, como parte da avaliação de sua biossegurança

ARAGÃO, F. J. L.

DEL PELOSO, M. J.

FARIA, J. C. de

VALDISSER, P. A. M. R.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Herança dos transgenes e associação com a resistência ao Bean golden mosaic virus em populações de feijoeiro comum derivadas da linhagem Olathe 5.1.

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 Documentos, IAC, Campinas, 85, 2008  368 HERANÇA DOS TRANSGENES E ASSOCIAÇÃO COM A RESISTÊNCIA AO Bean golden mosaic virus EM POPULAÇÕES DE FEIJOEIRO COMUM DERIVADAS DA LINHAGEM OLATHE 5.1  Josias Corrêa de FARIA1 Paula Arielle M. Ribeiro VALDISSER1 Francisco José Lima ARAGÃO2 Maria José DEL PELOSO1  INTRODUÇÃO  O mosaico dourado do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), transmitido pela mosca branca Bemisia tabaci, é uma das principais doenças da cultura, causando perdas de produção de 40 a 100%. Não foi identificado alto grau de resistência genética a esta doença no germoplasma do gênero Phaseolus. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante novas oportunidades de obtenção de resistência utilizando sequências genômicas do próprio agente causal se tornaram realidade. Os geminivirus associados ao feijoeiro são transmitidos pela mosca branca (Bemisia tabaci Gen.), e pertencem à família Geminiviridae, gênero Begomovirus. Todos os geminivirus possuem DNA circular, de fita simples encapsidado em partículas geminadas. O genoma é dividido em dois componentes, denominados de A e B. O DNA A possui os genes envolvidos na replicação viral (rep), capa protéica (cp), além de um gene envolvido com a amplificação da replicação viral (ren) e outro que é um fator de transcrição viral (trap). No componente B existem dois genes. O gene mp codifica uma proteína com funções de movimento célula-a-célula, análogas às da proteína 30K do TMV. O gene ns codifica uma proteína que realiza a etapa extra que os geminivirus devem realizar para causar infecção sistêmica - o transporte do DNA através do envelope nuclear. O produto do gene rep é uma enzima com propriedades de ligação à ácidos nucléicos e de endonuclease. Esta é a única proteína essencial para a replicação do genoma viral. Ela não possui, entretanto, atividade de DNA polimerase. Dessa forma, não é considerada uma replicase, mas sim uma enzima “associada à replicação do DNA”. A síntese de DNA propriamente dita deve ser realizada por enzimas do hospedeiro. A função da proteína REP é de se ligar ao sítio de iniciação da replicação viral e cortar uma das fitas de DNA, iniciando o processo. Com este conhecimento foi desenhado um transgene capaz de atuar ao nível do RNA do gene rep, de modo a destruí-lo. Isto foi conseguido com a tecnologia de interferência do RNA ou RNAi. Deste modo o gene rep é silenciado, e o vírus não pode se replicar. Um evento elite – Olathe 5.1- foi obtido e caracterizado tanto ao nível de resistência ao mosaico dourado como ao nível molecular (BONFIM et al., 2007). A herança mendeliana de um transgene é um requerimento para que o mesmo possa ser efetivamente utilizado nas cultivares comerciais derivadas, e padrões de herança mendeliana de transgenes são tipicamente observados em plantas. Há casos, porém, em que se observa segregação não-mendeliana de transgenes, com grande variação entre transformantes e suas progênies. É sabido que a herança estável de um transgene depende da sua natureza, do genoma no qual ele será inserido e do sítio de integração no genoma da planta, fatores sobre os quais não se tem controle no momento da transformação genética. A eliminação e o silenciamento de transgenes também podem explicar distorções na segregação das progênies,                                                  1 Embrapa Arroz e Feijão, Caixa Postal 179, 75375-00, Santo Antonio de Goiás, GO, E-mail: josias@cnpaf.embrapa.br 2 1Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB W5 Norte, 70770-900, Brasília, DF, E-mail: aragão@cenargen.embrapa.br  Documentos, IAC, Campinas, 85, 2008  369 como uma forma de defesa do genoma em algumas espécies. Assim, há exemplos de estudos nos quais apenas um, ou nenhum dos transgenes inseridos é herdado pela progênie de algumas linhagens, ou ainda os dois transgenes são inseridos em locos diferentes, ocorrendo muitas vezes a integração de múltiplas cópias do transgene no genoma da planta. O objetivo deste trabalho foi o de contribuir no estudo da estabilidade do transgene e sua herança através de várias gerações dos cruzamentos e retrocruzamentos em diferente germoplasma de feijoeiro comum com a linhagem Olathe 5.1, como parte da avaliação de sua biossegurança.  MATERIAL E MÉTODOS  Partindo-se de plantas de Olathe 5.1 homozigotas para o transgene foram realizados cruzamentos envolvendo os genitores Olathe Pinto, Jalo Precoce, Dark Red Kidney 18, BRS Supremo, BRS Pontal e Pérola, utilizando-se o transgênico sempre como parental doador de pólen, a fim de facilitar a análise das progênies: As plantas F1 dos cruzamentos com BRS Pontal e Pérola foram utilizadas como doadores de pólen para obtenção dos retrocruzamentos RC1 e assim, sucessivamente até o retrocruzamento RC4. A partir da geração RC4F2 as plantas transgênicas, sem mosaico dourado, foram conduzidas pelo método de descendência de uma única semente. Todas as plantas de cada geração desde o F1, ou segregantes foram analisadas quanto à presença do transgene utilizando-se de um par de oligonucleotídeos específicos. Para a análise da resistência ao mosaico dourado foram incluídos como testemunhas 10 plantas dos parentais não transgênicos e 10 do parental transgênico Olathe 5.1. Para facilitar o manuseio e reduzir o espaço inicial requerido para o cultivo e manuseio das plantas na fase inicial, as sementes foram semeadas em copos de 200-300 ml de capacidade preenchidos com solo previamente adubado. Aos sete dias após o semeio, as plântulas já com as folhas primárias expandidas, foram transferidas para o local apropriado de criação de colônia de moscas brancas virulíferas, desenvolvidas sobre plantas de feijão de lima (P. lunatus) e soja (Glycine max), a fim de serem inoculadas. . O número de moscas brancas utilizadas não foi controlado, tendo variado de 300 a mais que 1000 por plântula, permanecendo em contato com as moscas por oito dias. Após este período as moscas foram removidas e as plântulas foram transplantadas para vasos com 3 a 5 Kg de solo, onde foram mantidas até o final do ciclo. Durante a condução do ensaio as plantas foram pulverizadas com inseticidas e fungicidas para evitar a proliferação de moscas brancas e para o controle de oídio sempre que necessário. Essas foram avaliadas visualmente quanto à presença/ausência de sintomas de mosaico dourado até aos 40 dias após a inoculação. Em casos de dúvidas, a presença do vírus foi detectada por meio de PCR utilizando um par de oligonucleotídeo específicos para o mesmo. Os resultados obtidos foram analisados por qui-quadrado a fim de se comparar as possíveis divergências entre as proporções esperadas e observadas de plantas transgênicas ou de resistentes/suscetíveis após os cruzamentos.  RESULTADOS E DISCUSSÃO  Geração F1 Detecção do transgene: foi observada a banda de DNA esperada para as plantas transgênicas, a qual esteve sempre ausente nos controles com DNA de feijoeiro comum convencional e com substituição de DNA por água (Fig. 1). Todas as plantas F1 foram transgênicas indicando o sucesso do cruzamento e também a normalidade da transferência do transgene.  Resistência/suscetibilidade ao MD: decorrido o período de incubação do vírus houve o aparecimento de sintomas típicos da virose (Tabela. 1). Todas as plantas transgênicas  Documentos, IAC, Campinas, 85, 2008  370 parentais (Olathe 5.1) permaneceram sem sintomas e todas as plantas testemunhas das cultivares convencionais apresentaram sintomas típicos da doença.   Figura 1. Amplificação do transgene em plantas de feijoeiro comum da geração F1. Nota-se a ausência de bandas nos controles específicos utilizados.  Tabela 1.  Cruzamento Transgênicas Resistentes Suscetíveis % Suscetíveis Olathe 5.1 X Jalo Precoce 20 13 7 35,0 Olathe 5.1 X Olathe Pinto 20 17 3 15 Olathe 5.1 X Dark Red Kidney 18 20 13 7 35,0 Olathe 5.1 X BRS Supremo 20 8 2 10,0 Olathe 5.1 X BRS Pontal 58 37 21 30,2 Olathe 5.1 X Pérola 36 29 7 19,4 Parental Olathe 5.1    0,0  Gerações segregantes  Detecção do transgene na quarta geração do quarto retrocruzamento (F4RC4): todas as plantas transgênicas foram positivas por PCR na geração F4RC4 (Tabela 2).  Resistência/suscetibilidade ao MD: os resultados obtidos para a inoculação com o VMDF encontram-se na Tabela 2, onde o teste de qui-quadrado mostra que as relações de transgênico: não-transgênico observadas foram conforme o esperado. Em geral, houve a co-segregação da presença do transgene e da resistência ao vírus do mosaico dourado no caso do cruzamento com Pérola e seguiram os padrões mendelianos para um único lócus, embora não se possa afirmar que exista apenas uma única cópia. No experimento com o cruzamento com BRS Pontal houve vários escapes no controle suscetível, e várias plantas, que não tinha o transgene, também se comportaram como resistentes, ou vice-versa, afetando a relação esperada resistente:suscetível. As plantas segregantes apresentaram fenótipo normal.     Documentos, IAC, Campinas, 85, 2008  371 Tabela 2. Segregação observada na geração F4RC4 com as cultivares BRS Pontal e Pérola Olathe 5.1 X Pontal PCR Mosaico Dourado Geração F4RC4 Observadas Esperadas Observadas Esperadas Positivas 64 63,8 70 61,5 (sem MD) Negativas 21 21,3 12 20,5 (com MD) Total 85  82  BRS Pontal - - 16 de 20 inoc. 20 com MD Olathe 5.1   0 de 20 inoc 0 com MD Qui-quadrado, 3:1 0,004 (P≥95)**  4,7 (P≥0,02) n.s.  Olathe 5.1 X Pérola     Geração F4RC4     Positivas 34 33,75 34 (sem MD) 33,75 Negativas 11 11,25 11 (com MD) 11,25 Total 45    Qui-quadrado  0,007 (P≥0,95)** 0,007 (P≥0,95)**  Pérola   20 de 20 inoc. 20 com MD Olathe 5.1   0 de 20 inoc. 0 com MD ** - significativo; n.s.= não significativo  Todas as linhagens conduzidas por descendência de uma única semente que supostamente deveriam estar em homozigose, se comportaram como resistentes ao mosaico dourado, semelhante ao observado para a planta parental Olathe 5.1, para ambos os cruzamentos. Entretanto, no caso de heterozigotas, o padrão observado de resistência ao mosaico dourado é coerente com o conceito de “efeito de dosagem gênica” ou expressividade (RIEGER et al., 1976), onde há a ação diferencial dos alelos de um gene sobre a expressão fenotípica do caráter em questão. Obviamente que o PCR avalia apenas a presença do gene, enquanto a inoculação revela o seu efeito.  Como conclusão pode-se afirmar que a herança seguiu o padrão mendeliano com segregação típica monogênica dominante, mas existindo um efeito de expressividade gênica marcante, que possa causar desvios significativos na proporção esperada de segregação.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  RIEGER, R.; MICHAELIS, A.; GREEN, M. M. Glossary of genetics and cytogenetics – classical and molecular. Fourth completely revised edition. Springer Verlag, New York. 647p. 1976. BONFIM, K.; FARIA, J. C.; NOGUEIRA, E. O. P. L.; MENDES, E. A.; ARAGAO, F. J. L. RNAi-Mediated Resistance to Bean golden mosaic virus in Genetically Engineered Common Bean (Phaseolus vulgaris). Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 20, p. 717-726, 2007  Apoio: EMBRAPA e FINEP  Área: Genética e Melhoramento  

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/217695/1/179.pdf

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