ALMEIDA, A. M. R.

BELINTANI, P.

CORTEZI, D.

GASPARJ. O.

KITAJIMA, E. W.

MITUTI, T.

NUNES, C. L.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

140 	Embrapa Soja. Documentos, 268 Identificação de um isolado de carlavirus em Arachis pinto! Krap & Greg. Tatiana Mituti'; Daniele Cortezi'; Camila L. Nunes'; Elliot W. Kitajima 2'; Priscila Belintani 3 ; José O. Gaspar 3 ; Álvaro Manoel Rodrigues Almeida 4 . ' Graduanda da UNIFIL; 2 ESALQ; 3 I13I1-CE/UNESP; 4 Embrapa Soja. Introdução Arachis repetis Handro, planta da família Fabaceae (http:11scisun.nybg.org:88901 searchdb/owa/wwwcatalog.detail_list?this_id=4062504At) tem sido utiliza-da em jardinagem como cobertura de solo. A planta é cultivada como forração à maneira de gramado, apresentando folhagem sempre verde que lhe confere notável efeito decorativo. Algumas plantas de jardins localizados na área urbana de Londrina, PR e em áreas rurais, protegendo curvas de nível, apresentavam folhas reduzi-das e com sintomas de mosaico (Fig. lA). Esses sintomas sugeriam a presença de vírus. Figura 1. (A) Sintomas de mosaico observados em plantas de Arachis repons Handro naturalmente infectadas. (B) Fotomicrografia de particula do vírus identificado em plantas de Arachis repetis Handro, com sintomas de mosaico. Jorna da acadêmica da Embrapa Soja 	 141 Como essas plantas também aparecem próximas a campos de soja, pro-curou-se identificara possível ocorrência de vírus em Arachi.s repens atra-vés de ensaios de estudos de gama de hospedeiras, transmissão mecâ-nica, microscopia eletrônica, purificação e sorologia. Material e Métodos Coleta de plantas e multiplicação. Hastes de plantas com sintomas de mosaico foram retiradas das plantas e transplantadas para solo estéril. Após cerca de 30-45 dias, folhas com sintomas foram utilizadas como fonte de inóculo para estudos de hospedeiras diferenciais. Microscopia eletrônica. Amostras de folhas com sintomas de mosaico foram analisadas em microscopia eletrônica de transmissão ('leaf dip") segundo Kitajima & Nome (1999) Gama de hospedeiras. Plantas da espécie Phaseolus vulgaris (varieda-des Jalo, Manteiga, IAPAR 144, Carnaval, Rosinha e Tibagi) e Glycine max cv. CD 206 foram inoculadas com suspensão viral obtida a partir da maceração de tecido foliar sintomático, na presença de tampão fosfato de potássio 0,0I1V1, pH7, utilizando carvão vegetal finamente moído como abrasivo. Após a inoculação, as plantas foram lavadas e mantidas em casa-de-vegetação. As avaliações foram feitas aos 14 e 21 dias após a inoculação. Purificação. Folhas de plantas infectadas foram coletadas e moídas em tampão fosfato de potássio 0.5 M, pH 7.0, contendo 0,005M EDTAe sulfito de sódio 0,1%, na proporção 1:2 (glv) segundo Gaspar & Costa (1993). O macerado foi filtrado em gaze e, em seguida, clarificado com % volume da mistura de clorofórmio e tetracloreto de carbono (1:1), sob agitação por 30 mm. Após a clarificação, o material foi submetido à centrifugação de 10.950 g por 15 mm. O sobrenadante foi coletado, adicionando Triton X-1 000.5% e PEG 80006% e mantendo sob agitação constante por duas horas a 4°C. Após esse período, o material foi centrifugado por 15 min a 10.950 g e o precipitado ressuspendido em 10% do volume inicial (tam-pão fosfato de potássio 0,51V1, 0,02M EDTA, Triton X-100 0,1% e DTT 1M 142 	 Em/napa Soja. Documentos, 268 01%) e ficando sob agitação por aproximadamente 12horas. O material foi novamente submetido à centrifugação por 15 minutos (10.950 g). O sobrenadante foi coletado e ultracentrifugado a 110.000 g por 90 mm. A preparação semipurificada do vírus foi submetida a gradiente de sulfato de césio (50%-10%), o qual foi ultracentrifugado a 110.000 g por duas horas. A banda resultante foi recolhida e submetida a uma nova ultracentrifugação nas mesmas condições anteriores. Eletroforese de proteína capsidial. A massa molecular da proteína capsidial foi determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% com SDS, descrito por Laemmli, 1970. A análise foi realizada à temperatura ambiente, com utilização do tampão Tris-Glicina pH8.3, a 120v, durante uma hora. Após a eletroforese, o gel foi retirado da placa e corado com Comassie Blue R 250. O cálculo da massa molecular da proteína capsidial foi determinado pela regressão linear obtida com a distância migrada pelos padrões de proteínas utilizadas e as respectivas massas moleculares. ELISA indireto. O teste de ELISA indireto (Koenig, 1981) foi feito utilizan-do anti-soro obtido pela imunização de coelhos com preparações purificadas do Cowpea mild mott/e virus (CMMV), um membro do gênero carlavirus. A imunoglobulina G (lgG) foi obtida após purificação do anti-soro. Utilizaram-se duas diluições da lgG (1:500 e 1:1000). O extrato ve-getal foi utilizado nas diluições de 1:300, 1:500 e 1:1200. Duas outras espécies vegetais, infectadas pelo CMMV foram utilizadas além de A. repens. A amostra de folhas de feijão 'Jalo' sadio foi utilizada como con-trole negativo. Resultados e Discussão A análise de microscopia eletrõnica demonstrou a presença de partículas alongadas, com cerca de 650 nm, típicas de vírus do grupo carlavirus (Fig. IB). Os sintomas induzidos em diferentes plantas hospedeiras e a reação de plantas infectadas demonstraram que o vírus possui estreita gama de hospedeiras. Jornada académica da Embrapa Soja 	 143 Sintomas de clorose nas plantas de feijão inoculadas apareceram cerca de 16 dias após a inoculação, e todas as variedades inoculadas apresen-taram resposta positiva à infecção do vírus, comprovando a ocorrência de um agente infeccioso. Eletroforese feita a partir de suspensão purificada do vírus mostrou banda com massa molecular de 33 kDa, similar àquela observada com o CMMV (Fig. 2). 97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa 14,4 kDa Figura 2. Eletroforese de proteina capsidial do virus isolado de Arachís repens Handro. Os resultados obtidos por ELISA indireto demonstram que o anti-soro re-agiu com todas as amostras infectadas, incluindo a amostra de A. repens, o que demonstra ser o vírus estudado, o CMMV. Todas as diluições utili-zadas de lgG e de antigeno (extrato foliar infectado) apresentaram resul-tados positivos (Fig. 3). O vírus isolado de A. repens infectou apenas plantas da família Fabaceae. Arachis repetis é normalmente multiplicado por estaquia, o que deve co-laborar para sua disseminação. Embora não tenha sido testado, acredita-se que sua disseminação seja através de mosca branca, similar à trans-missão do CMMV. 744 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 0,9 0,8 E 	 0,7  	0,6 	 O Soja (VNHS) ' 	300 1ljhJTulL)hiJhll lgG 1:500 	 IgG 1:1000 Diluições Figura 3. Absorbância observada entre amostras infectadas e sadias por ELISA indireto, utilizando lgG purificada contra o Cowpca miM mottlo vírus. Amostras diluídas em 1:300, 1:500 e 1:1200. Referências GASPAR, J.O.; COSTA, A.S. Vírus do mosaico angular do feijoeiro: purificação e ultraestrutura dos tecidos infectados, 1993. 534-540 p. (Fitopatologia brasileira, 18). KITAJIMA, E.W.; NOME, C. F. Microscopia electronica em virologia vege-tal. In Docampo, D.M. & Lenardôn, S.L. eds. Métodos para detectar patógenos sistémicos. Córdoba, IFFIVE/INTA-JICA, 1999. 59-87 p. KOENIG, R. lndirect ELISA methods for the broad specificity detection of plant viruses, 1981. 53-62 p. (Journal of Geneneral Virology, 55). LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, 1970. 680-685 p. (Nature 227). 

Identificação de um isolado de carlavirus em Arachis pintoi Krap & Greg.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/469398/1/ID26413.pdf

Identificação de um isolado de carlavirus em Arachis pintoi Krap & Greg.

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