BANGEL, E.

BARCELLOS, F. G.

BATISTA, J. S. da S.

CAMPO, R. J.

HUNGRIA, M.

MENNA, P.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Análise filogenética de rizóbios, utilizados em inoculantes comerciais brasileiros, com base no sequenciamento do gene ribossomal 16S.

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ni 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 Análise filogenética de rizóbios, utilizados em inoculantes comerciais brasileiros, com base no seqüenciamento do gene ribossomal IGS Pâmela Menna'; Fernando Gomes Barcellos 2 ; Jesiane Stefânia da Silva Ba-tista 3 ; Eliane Bange1 4 ; Rubens José Campo 5 ; Mariangela Hungria 5 . 1 Bolsista de mestrado da CAPES; 2 Bolsista de pôs-doutorado do CNPq; 3 Bolsista de mestrado da Embrapa; 4 FEPAGR0; 5Embrapa Soja. Introdução Rizóbios são bactérias capazes de fixar o nitrogênio atmosférico (N 2) e convertê-lo a uma forma assimilável pelas plantas, quando em simbiose com determinadas plantas da familia Leguminosae (Hungria, 1994). Esse processo, conhecido como fixação biológica do nitrogênio (FBN), permite suplementar ecossistemas naturais com novas quantidades de nitrogênio (N), aproveitando a reserva inesgotável de N 2 presente na atmosfera (Drozdowicz, 1997). Contudo, apesar da importância ecológica e econô-mica, os rizóbios têm sido relativamente pouco estudados. Com  base nos dados de seqüenciamento do gene ribossomal 16S, existem atualmente cinco gêneros de rizóbios descritos, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, e mais de 40 espécies com-preendidas na subclasse alfa das proteobactérias (Garrity & Holt, 2001). Recentemente, o estudo da diversidade de rizóbios resultou na identifica-ção de novas espécies simbióticas, como no caso de bactérias do gênero Burkholdería ( Moulin et ai., 2001), pertencente à subclasse beta das proteobactérias, e Methy!obactehum ( Sy et ai., 2001), também na subclasse alfa. Como em muitas outras bactérias, as análises de diversidade, filogenia e taxonomia dos rizóbios têm sido derivadas, principalmente, de seqüências nucleotidicas do gene 1 6S rRNA. Ouso desse gene se deve à constatação de que ele é suficientemente conservado, o que permite o estabelecimento de relações evolucionárias universais, entretanto, com variabilidade suficiente para permitir a classificação bacteriana (Wang & Martinez-Romero, 2000). Jornada académica da Embrapa Soja 	 129 No Brasil, diferentes instituições de pesquisa são depositárias de cole-ções de culturas de rizábios, provenientes de distintas leguminosas, sen-do que a "Coleção de Culturas SEMIA" do Centro de Pesquisa de Fixação Biológica do Nitrogênio, da Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Sul (FEPAGRO), é a responsável pela manutenção e distribuição de estirpes recomendadas para o uso em inoculantes comer-ciais. Algumas dessas leguminosas são de grande importância econômi-ca nacional ou regional, como a soja, o feijoeiro, a ervilha, o feuão-de-corda, o amendoim, a alfafa, os trevos e diversas leguminosas arbóreas utilizadas em programas de recuperação de áreas degradadas e para reflorestamento. Embora a coleção de cultura 'SEMIA" seja um reservatá-rio de estirpes de rizóbios, resultantes de programas de seleção durante décadas, muito pouco se conhece sobre a diversidade e relações genéti-cas existentes entre as mesmas e suas respectivas plantas hospedeiras, em regiões tropicais. Objetivos Determinar as relações filogenéticas e, assim, inferir as posições taxonômicas, com base no seqüenciamento do gene ribossomal 165, de 68 estirpes SEMIA recomendadas como inoculantes para 64 leguminosas de importância econômica e/ou ambiental para o Brasil. Material e Métodos - Estirpes utilizadas Foram analisadas 68 estirpes provenientes da FEPAGRO, denominadas SEMIA (Secção de Microbiologia Agricola), isoladas de 46 distintas leguminosas e recomendadas, como inoculantes, para 64 leguminosas. Extração do DNA e amplificação por PCR da região do DNA que codifica para o gene 16S RNAr e purificação dos produtos obtidos A extração do DNA foi realizada conforme descrito por Fernandes et ai. (2003). 0 DNA obtido foi diluído a 20 ng de DNA pL 1 e, a seguir, mantido 730 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 a -20 0 C. O DNA de cada estirpe foi amplificado com "primers" para a re-gião do gene ribossomal 16S, conforme descrito por Weisburg etal. (1991). Os produtos de PCR obtidos foram, posteriormente, precipitados utihzan-do o protocolo de precipitação por acetato de amônio (7,5M) e etanol. Após a precipitação, a concentração do DNA de cada amostra foi verificada em gel de agarose a 1.5%, ajustada para 40 ng DNA pL e mantida a - 20°C. - Seqüenciamento e análise do gene 16S rRNA Os produtos de PCR obtidos de cada estirpe (80 ng por reação) recebe-ram uma mistura de 3 iL  de dye (DYEnamic ET terminator reagente para o MegaBACE, Amersham Biosciences), e 3 pmol de cada "primer". Para que a seqüência completa do gene 16S rRNA fosse obtida, foram realiza-das cinco reações com os seguintes primers fDl, Y2, (Fernandes et aI., 2003) e 362f, 786f e 1203f (Prof. Leonardo M. Cruz, Dept. de Bioquimica, UFPR, Curitiba, PR, Brasil). Após amplificação, cada 20 pL de reação foram precipitados utilizando o protocolo de precipitação com acetato de amônio (7,5M) e etanol e, então, procedeu-se ao seqüenciamento (MegaBACE 1000 DNA). As seqüências obtidas foram reunidas em "contigs" usando os programas phred, phrap e consed e depositadas no Banco de dados (GeneBank), onde receberam um número de acesso de AY904726 a AY904789. Posteriormente, uma árvore filogenética foi construída, utilizando uma análise de "bootstrap" de 2.000 repetições e o coeficiente de Neighbour Joining (NJ). Resultados O dendrograma resultante, após a análise das seqüências do 16S RNAr, revelou heterogeneidade e dividiu as estirpes em nove grupos principais, reunidos em um nível de similaridade de 77,8%. Sete destes grupos fo-ram relatados aos gêneros/espécies de Bradyrhizobium japonicum, S. e/kanii, Rhizobium tropicilA grobacterium (reciassificado como Rhizobium), IR. Ieguminosarum, Sinorhizobium me!iloti/S. fredif, Mesorhfzobium ciceri/ M. !oti, e Azorbizobium caulinodans (Fig. 1). Foi possível observar alguns agrupamentos distintos, com estirpes apre- Jornada acadêmica da Embrapa Soja 163 rRNA,1450 NJ, .10, boct2000 76 A2olhizobiurn sp. I.leorhizobiuru 6.rneli!oti Rhizobiurn sp. Age ob a cl erlu m 99 	 R Iis384 	Rhizobiurn + 4grobacteiurn 64 	 R.Iegurnincsarum - .. 	 Cuikholderia 0.02 Figural. Árvore filogenética, baseada no seqüenciamento de gene 16S rRNA, de 65 estirpes simbiontes de 46 leguminosas e oficialmente recomendadas para o uso em inoculantes comerciais brasileiros, bem como de estirpes-tipo e estirpes utilizadas como referência das espécies de rizóbios. Análise considerando o algoritmo Neighbour Joining e os números indicam os resultados obtidos na análise por "bootstrap" com 2000 repetições. sentando discrepância em mais de 15 nucleotídeos das estirpes-tipo, su-gerindo que essas podem estar relacionadas a novas espécies e, desse modo, foram classificadas como "sp.". Os resultados demonstraram uma elevada promiscuidade quanto à plan-ta hospedeira, com estirpes estabelecendo simbiose com leguminosas pertencentes a distintas tribos e até mesmo distintas subtamilias. Desse modo, os resultados demonstraram não haver correlação evolucionária entre as estirpes analisadas e suas respectivas plantas hospedeiras, em regiões tropicais. Considerações Finais 131 99 A comparação de seqüências do gene ribossomal 16S demonstrou ser 132 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 uma ferramenta poderosa para deduzir relações filogenéticas e evolucionárias, além de definir posições taxonômicas entre bactérias ca-pazes de fixar N em simbiose com leguminosas. O grau elevado de di-versidade genética observado entre as estirpes demonstra que as regi-ões tropicais são importantes reservatórios de genes de fixação de nitro-gênio 1 os quais ainda necessitam ser explorados. Agradecimentos Projeto financiado parcialmente pelo CNPq (47177312004-2, 301241/2004-0) e pelo PRONEX. Os autores agradecem a Ligia Maria O. Chueire pelo apoio na condução das análises. Referências DROZDOWICZ, A. Bactérias do solo. In: VARGAS, M.A.T.; HUNGRIA, M., (Ed.) Biologia dos solos dos cerrados. Planaltina: EMBRAPA-CPAC, 1997. p. 17-67. FERNANDES, ME; FERNANDES, R.RM.; HUNGRIA, M. Caracteriza-ção genética de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros eficientes em culturas do guandu e caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 38, p. 911-920, 2003. GARRITY, G.M.; HOLT, J.G The road map to the Manual. In: GARRITY, G.M.; BOONE, D.R.; CASTENHOLZ, R.W. (Ed.). Bergey's manual ofsystematic bacteriology 2ed. NewYork:, Springer-Verlag, 2001. vi, p.119-154. HUNGRIA, M. Sinais moleculares envolvidos na nodulação das leguminosas por rizóbio. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campi-nas, v.18, p. 339-364, 1994. MOULIN, L.; MUNIVE,A.; DREYFUS, B.; BOIVIN-MASSON, C. Nodulation of legumes by members of the b-subclass of Proteobacteia. Nature, London, v, 411, p. 948-950, 2001. SY, A.; GIRAUD, E.; JOURAND, E; GARCIA, N.; WILLEMS, A.; DE Jornada académica da Embrapa Soja 	 133 LAJUDIE, R; PRIN, Y.; NEYRA, M.; GILLIS, M.; BOIVIN-MASSON, C.; DREYFUS, B. Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and lix nitrogen in symbiosis with legumes. Journal of Bacteriology. Washing-ton, v. 183, p. 214-220, 2001. WANG, E.T.; MARTINEZ-ROMERO, E. Phylogeny of root- and stem-nodule bacteria associated with legumes. In: TRIPLETT, E.W. (Ed.). Prokaryotic nitrogen fixation: a model system for anatysis of a biological process. Madison: Horizon Scientific Press, p. 177-1 86, 2000. WEISBURG, W.G.; BARNS, S.M.; PELLETIER, DA.; LANE, D.J. 16S ribossomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, Washington, v. 173, p. 697-703, 1991. 

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/469395/1/ID26411.pdf

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