O aumento na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL) e peroxidase tem sido associado a respostas inespecíficas de defesa vegetal. Objetivou-se com este trabalho verificar aumento na atividade dessas enzimas em plantas de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], cv. Rouxinol, oriundas de sementes tratadas com acibenzolar-S-metil (ASM) e desafiadas por Macrophomina phaseolina, agente causal da podridão cinzenta do caule. O experimento foi organizado em delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 9 (tratamentos versus tempo de coleta) e três repetições. Os tratamentos foram representados pelo indutor (ASM), indutor + patógeno (ASM+MP), água + patógeno (H2O+MP) e testemunha absoluta (H2O). Os tempos de coleta foram: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 e 96 horas, após a semeadura e inoculação. Cada repetição foi representada por três sementes/plântulas. A atividade da FAL foi aumentada pela aplicação de ASM, especialmente nas 60 horas após a inoculação, sendo o mesmo verificado para peroxidase às 72 horas

ATHAYDE SOBRINHO, C.

BRUNELLI, K. R.

CAVALCANTI, L. S.

MENTEN, J. O. M.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

1Embrapa Meio-Norte, Caixa Postal 01, CEP 64006-220, Teresina, PI. E-mail: candido@cpamn.embrapa.br2UNIVASF, Rodovia Juazeiro-Sobradinho, s/n, CEP 56314-520, Juazeiro, BA. E-mail: leonardo.cavalcanti@univasf.edu.br3SAKATA. E-mail: katia.brunelli@sakata.com.br4ESALQ/USP, C.P. 09, CEP 13-417-900, Piracicaba, SP. E-mail: jomenten@esalq.usp.brDINÂMICA DE FENILALANINA AMONIA-LIASE E PEROXIDASE EM FEIJÃO-CAUPI TRATADO COM ACIBENZOLAR-S-METILC. ATHAYDE SOBRINHO1 , L. S. CAVALCANTI2, K. R. BRUNELLI3 e J. O. M. MENTEN4Resumo – O aumento na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL) e peroxidase temsido associado a respostas inespecíficas de defesa vegetal. Objetivou-se com este trabalho verificaraumento na atividade dessas enzimas em plantas de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.], cv.Rouxinol, oriundas de sementes tratadas com acibenzolar-S-metil (ASM) e desafiadas porMacrophomina phaseolina, agente causal da podridão cinzenta do caule. O experimento foi organizadoem delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 9 (tratamentos versus tempo decoleta) e três repetições. Os tratamentos foram representados pelo indutor (ASM), indutor + patógeno(ASM+MP), água + patógeno (H2O+MP) e testemunha absoluta (H2O). Os tempos de coletaforam: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 e 96 horas, após a semeadura e inoculação. Cada repetiçãofoi representada por três sementes/plântulas. A atividade da FAL foi aumentada pela aplicação deASM, especialmente nas 60 horas após a inoculação, sendo o mesmo verificado para peroxidase às72 horas.Palavras-chave: Fisiologia vegetal, tratamento de sementes.PHENYLALANINE AMMONIA-LYASE AND PEROXIDASES DYNAMIC INCOWPEA PLANTS TREATED WITH ACIBENZOLAR-S-METHYLAbstract – Increase in the fenilalanine ammonia-lyase (FAL) and peroxidases activities has beenassociated with general plant defenses mechanism. This work aimed to verify increases in theactivities of fenilalanine ammonia-lyase (FAL) and peroxidases enzymes in cowpea plants (Vignaunguiculata (L.)  Walp.), cv.  Rouxinol, originated from treated seeds with acibenzolar-S-metil(ASM) and challenged by Macrophomina phaseolina, causal agent of charcoal root disease of cowpea.The experiment was set up in a randomized complete block design in split plot arrangement, withthree replicates. Treatments were assigned as factor A and time as factor B. The treatments wererepresented by the acibenzolar-S-metil (ASM), ASM + pathogen (ASM + MP), water + pathogen(H2O+MP) and control (water only).  The samples were collected at zero, 12, 24, 36, 48, 60, 72,84 and 96 hours after sowing and inoculation. Each replicates was represented by three seeds/plantlets. The FAL activity was increased by the application of ASM, especially at 60 hours afterinoculation. The same was observed for the peroxidase activity at 72 hours after inoculation.Keywords: Plant physiology, seed treatment.IntroduçãoO éster do ácido benzo (1,2,3) tiadiazole-7-carbotióico (ASM) tem sido apontado como umdos mais promissores indutores de resistência vegetal (Görlach et al., 1996; Kunz et al., 1997),sendo o primeiro produto comercial de uma nova geração de protetores de plantas (Lyon & Newton,1997). Jacobsen & Kiewnick (1998) observaram uma redução na severidade de mancha deCercospora em plantas de beterraba após aplicação foliar de ASM. Em pimentão, o ASM mostrou-se eficiente para induzir resistência a diversas bactérias, como Erwinia carotovora pv. carotovora,Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria e X. campestris pv. vesicatoria (Venâncio et al., 2000).Mais exemplos podem ser verificados em outros trabalhos, como os realizados por Anfoka (2000),Cavalcanti (2000), Silva (2002) e Resende et al. (2002).Em plantas de caupi inoculadas com Colletotrichum destructivum, o aumento da resistênciaem plântulas induzidas por ASM foi associado com um rápido e efetivo aumento na atividade deduas enzimas-chave na via dos fenilpropanóides (fenilalanina amônia-liase - FAL e chalcona isomerase- CHI), que levou a um acelerado acúmulo de substâncias do grupo dos flavonóides, kievitonas efaseolidina (Latunde-Dada & Lucas, 2001).No patossistema cacau-Verticilium dahliae, Cavalcanti (2000) e Resende et al. (2002)observaram aumento na atividade da enzima peroxidase, destacando ser essa uma importantealteração fisiológica no processo de resistência induzida, em resposta à pulverização de plântulasde cacaueiro com ASM.O presente trabalho objetivou investigar a dinâmica das enzimas fenilalanina amônia-liase(FAL) e peroxidase em plantas de feijão-caupi oriundas de sementes tratadas com ASM e desafiadaspor M. phaseolina.Material e MétodosO trabalho foi conduzido no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Parasitismo e em casade vegetação do Setor de Fitopatologia da ESALQ/USP, em Piracicaba-SP.As sementes de caupi, V. unguiculata cv. Rouxinol, foram obtidas na Embrapa Meio-Norte,em Teresina, PI. A aplicação do produto comercial à base de benzotiadiazole (ASM), formulaçãogrânulos dispersíveis a 50% (i.a.) foi realizada através da imersão das sementes em solução aquosa,ajustada a uma concentração de 25 ppm (i.a.) durante 24 horas. Em seguida, foram semeadas emvasos plásticos, com capacidade para cinco litros (12 sementes/vaso), nos quais foram colocadosquatro litros de substrato esterilizado.Empregou-se, como inóculo, o isolado de M. phaseolina MP103, obtido de sementes defeijão-caupi originárias do Estado do Piauí. O inóculo foi representado por cinco grãos de arroz “emcasca” esterilizados e colonizados com o isolado fúngico. A inoculação foi realizada imediatamenteapós a semeadura e constou da deposição direta do inóculo sobre as sementes, conforme metodologiamodificada de Abawi & Pastor-Corrales (1990).O experimento foi organizado em delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial4 x 9 (tratamentos versus tempo de coleta) e três repetições. Os tratamentos foram representadospelo indutor (ASM), indutor + patógeno (ASM+MP), água + patógeno (H2O+MP) e testemunhaabsoluta (H2O). Os tempos de coleta foram: zero, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 e 96 horas, após asemeadura e inoculação. Cada repetição foi representada por três sementes/plântulas.Imediatamente após a semeadura e inoculação, iniciou-se a coleta das amostras paradeterminação do teor de proteínas totais e análise da atividade das enzimas peroxidase e FAL. Asplântulas e sementes sem tegumento foram trituradas em pistilo e almofariz, em 10 mL da soluçãoextratora (tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 7, + 1 mg ditiotreitol (DTT) /mL de tampão),resultando nas amostras diluídas que foram utilizadas em todas as determinações.A atividade da peroxidase foi quantificada através da medida da absorbância a 470 nm dareação de oxidação do guaiacol (Cortelazzo et al., 1996). Para FAL utilizou-se a metodologia dePascholati et al. (1986). O teor de proteínas totais das amostras foi quantificado conforme metodologiade Bradford (1976).Resultados e DiscussãoObservou-se menor nível de atividade da FAL nos tratamentos inoculados com M. phaseolina(ASM+MP e MP), entre os tempos de 0 e 24 horas (Figura 1). Resultados semelhantes foramdestacados por Pascholati et al. (1986), para plantas de milho inoculadas com fungo incompatível.Por outro lado, altos níveis de atividade da enzima foram observados nos tratamentos com ASM às60 horas após a inoculação. Esse padrão de alteração na atividade da FAL mostrou-se semelhanteao observado no patossistema feijão-caupi-C. destructivum, em que a atividade da enzima mostrou-se significativamente superior nas plantas induzidas com ASM, 18 h após a inoculação (Latunde-Dada & Lucas, 2001).Com relação à enzima peroxidase, observou-se que sua atividade foi aumentando gradualmente,intensificando-se a partir das 36 horas após inoculação de forma indistinta em todos os tratamentos.Entretanto, maior atividade foi observada a partir das 72 e 84 horas, para os tratamentos ASM+MPe ASM, respectivamente. (Figura 2). Esse rápido aumento se assemelha, conforme Floot et al.(1997), às respostas típicas de interações incompatíveis. Alterações na atividade da peroxidasetêm sido observadas e descritas em plantas de tomate e algodão (Smit & Dubery, 1997), melão(Buzi et al., 2004), cacaueiro (Cavalcanti, 2000; Resende et al., 2002), ervilha (Dann & Deverall,2000), entre outros. No patossistema cacaueiro-Verticillium dahliae, Resende et al. (2002) observaramaumento significativo na atividade da enzima, induzido pelo tratamento ASM isoladamente ou emassociação com V. dahliae.Figura 1. Atividade de FAL em sementes e plântulas de caupi cv.Rouxinol tratadas com ASM e desafiadas por Macrophominaphaseolina01234560 12 24 36 48 60 72 84 96Tempo após inoculação (h)Atividade específica.mg proteina-1ASMASM+MPH2OMPAnalisando-se os efeitos resultantes da atividade biológica das enzimas FAL e peroxidase,diversos estudos têm destacado aumento da síntese de lignina nos tecidos vegetais (Buchanan etal., 2000; Oliveira et al., 2004), o que pode representar um aumento na capacidade de defesa deplantas contra patógenos.ConclusõesO Acibenzolar-S-metil (ASM) usado como tratamento de semente afetou a dinâmica dasenzimas fenilalanina amônia-liase (FAL) e peroxidase.Maior atividade da FAL foi verificada às 60 horas após a inoculação.Maior atividade da peroxidase foi verificada às 72 horas após a inoculação.ReferênciasABAWI, G.S.; PASTOR-CORRALES, M.A.  Root rots of bean in Latin America and Africa: diagnosis,research metodologies and management strategies.  Bogotá: CIAT, 1990. 114p.ANFOKA, G. H.  Benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester induces systemicresistance in tomato (Lycopersicon esculentum Mill vc. Vollendung) to Cucumber Mosaic Virus.Crop Protection, v. 19, p. 401-405, 2000BRADFORD, K.J.  Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germinationunder stress conditions.  HortScience, v. 21, p. 1105-1112, 1986.BUCHANAN, B. B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. (Ed.).  Biochemistry and molecular biology ofplants.  Rockville: ASPP, 2000. p. 1102-1156.BUZI, A.; CHILOSI, G.; DE SILLO, D.; MAGRO, P.  Induction of resistance in melon to Didymellabryoniae and Sclerotinia sclerotiorum by seed treatments with acibenzolar-S-methyl and methyljasmonate but not with salicylic acid. Journal of Phytopathology, v.152, p.34-42, 2004.CAVALCANTI, L. S. Indução de resistência a Verticillium dahliae Kleb. em plântulas de cacaueiro(Theobroma cacao L.) cv. Teobahia, por benzotiadiazole (ASM). 2000. 82f.  Dissertação (Mestrado)– Universidade Federal de Lavras, Lavras.Figura 2. Atividade de peroxidase em sementes e plântulas decaupi cv. Rouxinol tratadas com ASM e desafiadas porMacrophomina phaseolina.0123456780 12 24 36 48 60 72 84 96Atividade especifífica.mg proteina-1H20MPASMASM+MPTempo após inoculação (h)CORTELAZZO, B.E.; MARAIS, M.F.; LOSELEAU, J.P.  Changes in peroxidases in the suspensionculture of Rubus fruticosus during growth.  Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 46, p. 27-33, 1996.DANN, E.K.; DEVERALL, B.J. Activation of systemic disease resistance in pea by an avirulentbacterium or a benzothiadiazole, but not by a fungal leaf spot pathogen.  Plant Pathology, v.49, p. 324-332, 2000.FLOOT, B.E.; MOERSCHBACHER, B.M.; REISENER, H.J. Peroxidase isoenzymes patterns ofresistant and susceptible wheat leaves following stem rust infection.  New Phytologist, v. 111,p. 413-421, 1997.GÖRLACH, J.; VORATH, S.; KNAUF-BEITER, G.; HENRY, G.; BECKHOVE, V.; KOGEL, K. 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F.; NICHOLSON, R.L.; BUTLER, L.G. Phenylalanine ammonia-lyase activity andanthocyanin accumulation in wounded maize mesocotyls. Journal of Phytopathology, v. 115, p.165-172, 1986.RESENDE, M.L.V.; NOJOSA, G.B.A.; CAVALCANTI, L.S.; AGUILAR, M.A.G.; SILVA, L.H.C.P.;PEREZ,J.O.; ANDRADE, G.C. G.; CARVALHO,G. A.; CASTRO, R. M.  Induction of resistance incocoa against Crinipellis perniciosa and Verticillium dahliae by acibenzolar-S-methyl (ASM).  PlantPathology, v.5, p.621-628, 2002.SILVA, L.H.C.P. Resistência sistêmica ativada pelo acibenzolar-S-metil contra doenças em tomateiro.Lavras, 2002. 89p.  Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Lavras.SMIT, F.; DUBERY, I.A. Cell wall reinforcement in cotton hypocotyls in response to a Verticilliumdahliae elicitor.  Phytochemistry, v. 44, p. 811-815, 1997.VENÂNCIO, W.S.; ZAGONEL, J.; FURTADO, E.L.; SOUZA, N.L.; PERES, N.A.R. Novosfungicidas. II – Famaxadone e indutores de resistência.  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Dinâmica de fenilalanina amonia-liase e peroxidase em feijão-caupi tratado com Acibenzolar-S-Metil.

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