BERTON-JUNIOR, J. F.

HUNGRIA, M.

KASCHUK, G.

SANTOS, J. C. P.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Diversidade de rizóbios que nodulam o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) sob diferentes sistemas de manejo de solo em Campo Belo do Sul, SC.

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Jornada académica da Embrapa Soja 	 71 Diversidade de rizóbios que nodulam o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) sob diferentes sistemas de manejo de solo em Campo Belo do Sul, SC Glaciela Kaschuk 1 ' 2 ; Julio C.P. Santo5 3 ; João F. Berton-Junior4 ; Mariangela Hungria 1 . 1 Embrapa Soja; 2 ooutoranda sanduíche da Wageningen University, Holanda; 2 Prof. UDESC, Lages, SC; 3 Mestrando em Ciência do Solo, UDESC. Introdução Pouco se conhece sobre a dinâmica de populações microbianas da rizosfera, especialmente nos trópicos, embora já existam diversas e mo-dernas técnicas laboratoriais disponíveis para a condução desses estu-dos. A diversidade de grupos de microrganismos na rizosfera, por exem-plo, rizóbios, poderia representar um bom indicador de qualidade do solo, porque estes respondem rápida e sensivelmente às mudanças ambientais do solo e estão presentes em grande densidade de popula-ção. Além disso, o maior conhecimento do efeito dos sistemas de mane-jo do solo sobre as variações populacionais dos rizóbios pode contribuir para o delineamento de estratégias para incrementar a fixação biológica de nitrogênio (FBN), processo biológico fundamental à produção vege-tal sustentável. Torna-se essencial verificar, particicularmente em condi-ções tropicais, o efeito do manejo do solo na diversidade microbiana, bem como se alterações na diversidade resultam em maior susten-tabilidade agricola. Objetivos Caracterizar genet[icamente rizóbios microssimbiontes de feijoeiro em áre-as de plantio direto (PD), plantio convencional (PC) e campo nativo (CN) de Santa Catarina. 72 	 Embrapa Soja, Documentos, 268 Material e Métodos As amostras de solo foram coletadas em áreas sob PD, PC e CN em uma propriedade rural de Campo Belo do Sul, SC. A área de PD foi cultivada com feijoeiro (Phaseo/us vu/garis) e soja (G/ycine max), inoculados peno-dicamente, por 20 anos, sendo os últimos 10 anos sob PD. O teor de nutrientes foi corrigido e o pH foi ajustado para 5,5, segundo análise de solo. A área de PC foi explorada com agricultura por três anos. O pH tam-bém foi corrigido para 5,5, entretanto, o solo ainda apresentava algumas limitações de nutrientes, pois as produtividades foram inferiores àquelas obtidas no PD. Ambas as lavouras foram originalmente implantadas so-bre o CN e receberam todos os tratamentos fitossanitários necessários. A área de CN vinha sendo utilizada com pecuária extensiva, sem fertilizan-tes ou implantação de leguminosas, apenas manejada com uso de fogo no inverno. O solo de cada área foi diluído sucessivamente até a diluição de 10. Uma alíquota de 1 mL dessa diluição foi, então, inoculada sobre sementes de feijoeiro (cv. Pérola), previamente desinfestadas, para o plan-tio em areia esterilizada. As plantas foram cultivadas em casa de vegeta-ção por 30 dias e coletadas para retirada dos nódulos. Nódulos foram escolhidos aleatoniamente e os rizóbios foram isolados (Vincent, 1970). O DNA das bactérias foi extraído a partir de culturas puras de rizóbios em meio YMA, segundo procedimento otimizado (Kaschuk, 2003). O DNA foi amplificado pela técnica de PCR com o "primer" BOX-Al R (5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (Versalovic et ai., 1994) e os seus produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% por 6 horas. Em seguida, o gel foi corado com brometo de etídio (0,00005%), observado em transluminador UV e fotografado. Essa téc-nica verificou a variabilidade genética em nível de estirpes. O pohmorfismo foi analisado usando o programa Bionumerics (Applied Mathematics, Bélgica) com o algoritmo UPGMA, o coeficiente de Jaccard e tolerância de 2%. O DNA também foi amplificado com 'primers" que codificam a região do gene ribossomai 16S rRNA: Y1 (5'-TGGCTCAGAACGAACGCGTGGCGGC-3') e '(3 (3'-CTGACCCCAACTTCAGCAUGTTCCAT-5'). Os produtos dessas amplificações foram submetidas à metodologia de RFLP-PCR Jornada académica da Em/rapa Soja 	 73 (Laguerre et al.,1994), com as seguintes enzimas de restrição: Cfol; HintI, Mspl, Rsal e Mbo!. Os fragmentos obtidos foram aplicados em gel de agarose a 3% e corridos em sistema de eletroforese a 120 V durante 4 horas. O polimorfismo foi analisado visualmente e uma letra diferente foi dada a cada perfil distinto, agrupando-se os perfis semelhantes em um mesmo grupo de espécie. A comparação da diversidade de estirpes foi realizada pela distinção de perfis BOXA1 R a 70% de similaridade e pelo cálculo dos índices de diver-sidade, H' (Shannon & Weaver, 1949), de riqueza genética, RI (Margalef, 1958) e de equidade, E (Pielou, 1977). Também foi construída uma curva acumulativa dos perfis para análise comparativa da variabilidade. As estirpes utilizadas como referéncia foram CIAT 899 (Rhizobium tropici Tipo llB), CEN 299 (R. tropiciTipo lIA), CFN 42 (R. eU'), PRF 81 (R. tropici), H 152 (R. giardinhi bv. gallicum) e R 602 (/R. gal/icum bv. gailicum). Resultados e Discussão As técnicas moleculares demonstraram grande diversidade genética de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro nos solos estudados. Pela amplifica-ção do DNA por BOX Al R - POR foram obtidos 35 perfis das estirpes iso-ladas do PD, 36 do PC e 20 do CN. Essas amplificações resultaram em um grau elevado de polimorfismo entre as bandas das três áreas de origem. Os dendrogramas demonstraram que as bactérias apresentavam baixa si-milaridade entre si. As estirpes dos dendrogramas do PD, PC e ON foram agrupadas em níveis de similaridade de apenas 17, 23 e 36% respectiva-mente (dados não mostrados). Poucas bactérias assemelharam-se às es-tirpes utilizadas como referência e a maioria apresentou perfil único. Os perfis com 70% de similaridade na análise de BOX Al R - POR foram agrupados e uma estirpe representante de cada grupo foi escolhida para a análise de RFLP-PCR da região i6S rONA. Foram analisadas 24 estir-pes de cada sistema de plantio e 12 do CN. Uma grande variedade de perfis foi observada, forte indicativo de diversidade genética elevada, bem como de várias espécies novas, ainda não estudadas. 74 	 Embrapa Soja, Documentos, 268 A diversidade genética elevada observada é um fade indicativo de que muitas espécies de rizábios dos solos tropicais ainda não foram descri-tas. Esta situação já havia sido diagnosticada anteriormente (Grange & Hungria, 2004). A escolha da simbiose com feijoeiro provou ser um exce-lente modelo para estudos de diversidade rizobiana nos solos tropicais. A alta diversidade é, provavelmente, relacionada à natureza promíscua do hospedeiro, que se associa a uma grande diversidade de rizóbios (Michiels et aI., 1998). Os índices de diversidade obtidos com os perfis de BOX Al R - PCR fo-ram semelhantes nos sistemas PD (H=2,96, R1=6,47 e E=0,93) e PC (H'=3,02, R1=6,42 e E=0,95), contudo, foram inferiores no CN (H'=2,35, R1=3,67 e E=0,94). Os índices calculados com os perfis de RFLP - PCR da região do 16S rRNA evidenciaram diferenças de diversidade entre o PD (H'=3,12 e R1=6,92) e as demais áreas (PC: H=2.86 e R1=5.59; CN: H'2.09 e R1=3.21). O número acumulado de perfis indicou maior variabi-lidade genética no grupo de estirpes provenientes do PD e menor no gru-po do ON, em ambas as comparações (estirpes com BOX Al R - POR e espécies com RFLP - POR) (Fig. i). 25 — 	 - 	 . Plantio direto 25 - 	 - 	 - Plaittio direto Plantio convencional Plantio convencional 20 Qtnpo nativo - 20 üsirço nativo - --- , IS  E T Nu,,'cro,Iecstn1ws Ná ,,,e ro de es ti, 	 o Figura 1. Diversidade acumulada em função do número de rizóbios de feijoeiro avaliados e dos perfis obtidos com as técnicas de BOXAIR - PCR eu RFLP - PCR da região lOS rDNA em áreas de lavoura de Campo Belo do Sul, SC sob os sistemas de plantio direto (PD), plantio convencional (PC) e campo nativo (CN). Jornada académica da Embrapa Soja Considerações Finais Neste estudo, a diversidade genética de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro foi superior no sistema PD, quando comparada ao sistema PC a ao CN. Os benefícios do PD em relação ao PC, em vários parâmetros microbiológicos, tem sido evidenciado (Hungria & Vargas, 2000) e os menores valores observados no CN resultam do manejo inadequado com fogo no inverno. A maior diversidade microbiana é importante por garantir que as funções dos microrganismos do solo sejam preservadas no ambi-ente, representando um "efeito tampão". Os resultados indicam, ainda, a viabilidade de utilizar a diversidade genética de rizóbios com um indica-dor da qualidade do solo. Agradecimentos Projeto parcialmente financiado pela Fundação Araucária (convênio 0461 2003) e pelo CNPq (30124112004-0). Referências GRANGE, L.; HUNGRIA, M. Genetic diversity of indigenous common bean (Pha.seo/us vulgaris) rhizobia in two Brazilian ecosystems. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v.36, p.1389-398, 2004. HUNGRIA, M.; VARGAS, M.A.T. Environmental factors affecting N 2 fixation in grain legumes in the tropics, with an emphasis on Brazil. Field Crops Research, Dordrecht, v.65, p. 151-164, 2000. KASCHUK, G. Diversidade de rizóbios que nodulam o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) sob diferentes sistemas de manejo de solo. 2003. 79f. Tese. (Mestrado em Microbiologia) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina. LAGUERRE, G.; ALLARD, M.-R.; REVOY, F.; AMARGER, N. Rapid identification of rhizobia by restriction fragment Ienth polymorphism analysis of PCR-amplified 163 rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v.60, p.56-63, 1994. 76 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 MARGALEF, D.R. Information theory in ecology. General Systems, v.3, p.36-71, 1958. MICHIELS, J.; DOMBRECHT, B.; VERMEIREN, N.; Xl, O.; LUYTEN, E.; VANDERLEYDEN, J. Phaseolus vulgari.s is a non-selective host for nodulation. FEMS Microbiology Ecology, v.26, p.193-205, 1998. PIELOU, E.C. Mathematical Ecology. NewYork: Wiley, 1977. 385 p. SHANNON, C.E.; WEAVER, W. The mathematical theory of communication. Urbana: University Illinois Press, 1949. 117 p. VERSALOVIC, J.; SCHNEIDER, M.; DE BRUIJIN, E; LUPSKI, J.R. Genomic fingerprinting of bactéria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods of Molecular Ceil Biology, Oxford, v.5, p.25-40, 1994. VINCEN1 J.M. A Manual forthe practical study of root-nodule bacteria. Oxford: Blackwell Scientific, 1970. 164 p (IBP Handbook, n o . 15). 

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