BARCELLOS, F. G.

BATISTA, J. S. da S.

HUNGRIA, M.

MENNA, P.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Avaliação da eficiência na fixação biológica do nitrogênio com a cultura da soja e caracterização genotípica e da diversidade de estirpes de Bradyrhizobium japonicum.

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62 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 Avaliação da eficiência na fixação biológica do nitrogênio com a cultura da soja e caracterização genotípica e da diversidade de estirpes de Bradyrhizobium japonicum Fernando Gomes Barcellos 1 ; Pâmela Menna 2 ; Jesiane Stefânia da Silva Ba-tista 3 ; Mariangela Hungria 4 . 1 13oisista de pós-doutorado do CNPq; 2 Boisista de mestrado da CAPES; 38olsista de mestrado da Embrapa; 4 Embrapa Soja. introdução A fixação biológica do nitrogènio (FBN), através da inoculação da soja com estirpes selecionadas de bactérias do gênero Bradyrhizobiurn, tem sido essencial na viabilidade econômica da cultura no Brasil, dispensan-do o uso de adubação nitrogenada (Hungria et ai., 2005). Ouso das estir-pes selecionadas de Bradyrhizobium (B.japon/cum SEMIA 5079 e SEMIA 5080 e B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019) resulta em uma economia estimada em mais de 3 bilhões de dólares por safra (Hungria et ai., 2005). Entretanto, devido ao constante aprimoramento das práticas agrícolas, ao lançamento de cultivares mais produtivas e adaptadas às diferentes condições ambientais, bem como ao estabelecimento de populações de estirpes em solos previamente inoculados, faz-se necessário uma cons-tante busca por genótipos de Braclyrhizobiurn mais competitivos e eficien-tes no processo de FBN. Para esta busca é necessário um prévio conhe-cimento da diversidade genotipica existente em relação ás estirpes de Bradyrhizobiurn atualmente utilizadas nos inoculantes, assim como àque-las populações existentes nos solos das regiões cultivadas, as quais pas-saram por um processo de seleção natural e adaptação. O estudo comparativo entre genomas que diferem quanto à eficiência e competitividade na FBN constitui-se em uma estratégia importante para a elucidação das bases genéticas relacionadas a essas diferenças possibi-litando, assim, uma busca mais eficiente por genótipos de desempenho Jornada académica da Embrapa Soja 	 63 produtivo superior. O uso dos marcadores moleculares e os resultados obtidos a partir do seqüenciamento de genomas têm representado ferra-mentas importantes utilizadas nos estudos de diversidade e caracteriza-ção genotipica de inúmeros organismos. No gênero Bradyrhizobium exis-tem muitos estudos de diversidade e caracterização genotípica com o uso de marcadores moleculares, constatando-se, em geral, variabilidade ge-nética elevada (Lilly et ai., 2001). Isso também foi constatado com estir-pes de Bradyrhizobium isoladas no Brasil (Silva, 2003). A diversidade ob-tida através desses marcadores pode ser utilizada na busca de seqüênci-as gênicas relacionadas às diferenças existentes quanto à competitividade e eficiência na FBN, sendo essas seqüências posteriormente caracteriza-das. O Laboratório de Biotecnologia dos Solos da Embrapa Soja possui uma coleção com cerca de 1.500 isolados naturalizados, microssimbiontes de soja, bem como 150 estirpes de Bradyrhizobium provenientes de di-versas leguminosas hospedeiras. Visto que poucos laboratórios no mun-do estão estudando bactérias deste gênero, bem como pela importância das mesmas na FBN, tanto para a cultura da soja, como para diversas leguminosas nativas, torna-se estratégica a identificação de regiões gênicas relacionadas à FBN, visando a busca de genótipos superiores quanto à eficiencia na FBN. Do mesmo modo, também é importante iden-tificar regiões gênicas associadas à competitividade e capacidade saprofítica das estirpes. Objetivos Identificar e caracterizar genes relacionados à capacidade competitiva de estirpes e a eficiência na FBN com a cultura da soja, tomando como mo-delo estirpes de Bradyrhizobium japonicum. Material e Métodos Foram utilizadas 17 estirpes de B.japonicum provenientes da coleção do Laboratório de Biotecnologia dos Solos da Embrapa Soja. Duas dessas estirpes são consideradas parentais, SEMIA 586 e SEMIA 566 e as de- 64 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 mais são variantes naturais dessas estirpes, obtidas após adaptação ao solo, isto é, vários anos após a inoculação do solo e cultivo da soja. Foram desenvolvidas as seguintes atividades: Análise da eficiência de FBN das estirpes de B.japonicum escolhidas e inoculadas na soja; Ampli-ficação por rep-PCR ("repetitive regions - polymerase chain reaction", com os "primers" BOX-Al R e REP) dos DNAs das 17 estirpes de B. japon/cum; PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism", polimorfismo no comprimento de fragmentos de restriçâo), dos genes ribossomais 16S das 17 estirpes de B. japonicum; Agrupamento das estirpes B. japonicum segundo niveis de similaridade obtidos com a aplicação das técnicas de rep-POR e PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S. Resultados - Análise da eficiência da FBN das estirpes de B. japonicum escolhidas e inoculadas na soja As plantas inoculadas com as 17 estirpes de B. japonicum foram avalia-das quanto à massa da parte aérea seca (MPAS), número de nódulos formados na raiz (NN), massa dos nódulos secos (MNS), relação massa/ número de nódulos (MSN/NN), nitrogênio total acumulado na parte aérea (NTPA) e eficiência dos nódulos (NTPA/MNS). Os experimentos foram realizados com três repetições e as médias agrupadas pelo teste de Tukey (SAS, 1989). As estirpes de B. japonicum pertencentes ao mesmo sorogrupo (sorogrupo SEMIA 566 ou sorogrupo SEMIA 586) não pude-ram ser agrupadas com relação aos parâmetros avaliados, pois dentro de cada sorogrupo foram encontradas estirpes mais e menos eficientes, com variações significativas em todos os parâmetros analisados (Tabela 1). - Agrupamento das estirpes de B. japonicum segundo niveis de similari-dade com base nos marcadores rep-PCR (com os "primers" BOX-A1R e REP) e POR - RFLP dos genes ribossomais 165: Os DNA5 das 17 estirpes de B.japonicum foram amplificados por POR ("polymerase chain reaction, reação em cadeia de polimerase") com o uso do 'primer" BOX-A1R e REP. 0 gene ribossomal 165 foi amplificado Jornada académica da Embrapa Soja 	 65 ti a P2 z z O) z O) z z z O) a- o c cu o > O) O I0D 3 o 0 'a 	0 'O O co .9 CL I 0)10 .0 CO z o) wz 2Z cz a) 00 O) 'a 'a ' - C '0'0 3 c c c o C0 0. fl CO'3~ o g E 0) O z <a CO 	 C0 0)Z CO <o E 'a a, . _ç CO <aU) r CO ci .0 CO E- 00 000 no_o_o 	 .0.0.0 CO_o CO CO CO CO CO CO O r-rCoL0.- L00) (0 ('4 CO 03 03 0 0) CO C'J N.. 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Documentos, 268 por POR e o produto de amplificação submetido a chvagens com as enzimas de restrição Hhal, Hpall e Ddel. De acordo com os perfis de bandas apresentados, as estirpes foram agrupadas segundo níveis de similaridade. Com  base nos índices de similaridade obtidos, com exce-ção das estirpes S 127 e CPAC 402, as estirpes pertencentes ao mesmo sorogrupo (sorogrupo SEMIA 566 ou sorogrupo SEMIA 586) foram seme-lhantes entre si, sendo possível distinguir os dois grupos. Já as estirpes S 127 e CPAC 402 apresentaram perfis de bandas distintos dos dois sorogrupos, apresentando índices de similaridade com as demais estir-pes de 62,2% e 57,3%, respectivamente. Pelo seqüênciarnento do gene 165, constatou-se que a estirpeS 127 pertence, na verdade, à espécie B. elkanii, enquanto a CPAC 402 é uma estirpe de Sfnorhizobium sp. Desse modo, o estudo sugere que ocorre transferência lateral de genes de FBN para rizábios nativos do solo, o que está sendo confirmado pelo uso de outras técnicas moleculares. L1 1 	 34567091011121314151617 n 	 — r ----- p tlI nt4_fl *t_nt4 	 — — #o • S 	 rI*.øia. s s k 	 ' Figural. Amplificação por BOX-A1R PCR dos DNAs das 17 estirpes de B. japonicum. M - marcador de peso molecular (Ladder lKb plus); - 1 a 9: estirpes do sorogrupo SEMIA 566: SEMIA 566 e suas variantes CPAC 15 e 3 127, 340, 370, 372, 478, 490, 516 respectivamente; 10 a 17: estirpes do sorogrupo SEMIA 586: SEMIA 586 e suas variantes CPAC 7,390, 392, 394, 402, 403 e 404. Jornada académica da Embrapa Soja 	 67 Considerações Finais As metodologias de amplificação do DNA por rep-PCR , com os "primers" BOX-A1R e REP, bem como de PCR-RFLP dos genes ribossomais 165 com três enzimas de restrição mostraram-se eficientes em estudos de diversidade genética, identificação de estirpes e monitoramento de estir -pes de Bradyrhizobiurn no solo. Agradecimentos Projeto financiado parcialmente pelo CNPq 30124112004-0,40071012004-8) e pelo PRONEX. Os autores agradecem a Ligia Maria O. Chueire pelo apoio na condução das análises. Referências HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, O.; GRAHAM, P.H. Contribution of biological nitrogen fixation to the N nutrition of grain crops in the tropics: the success of soybean (G/ycine max L. Merr.) in South America. In: GRAHAM, P. H. Nitrogen nutrition and sustainable plant productivity. Houston, Texas: Studium Press, LLC, 2005. (no prelo). LILLY, M.S.; LOGANATHAN, P.; RANGARAJAN, 5.; NAIR, S. Genetio diversity and relationship between Bradyrhizobium strains isolated from blackgram and cowpea. Biology and Fertility o! Soils, Berlin, v. 34, p276-281, 2001. SAS Institute. SAS/STAT users guide, Version 6, Vol. 2, 4th ed. Cary, NO: SAS Institute Inc., 1999. SILVA, M.G.G. Avaliação da diversidade genética de Bradyrhizobium pela análise de genes ribossomais. 2003. 105 f. Tese (Mestrado em Microbiologia) - Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina. 

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/469087/1/ID26398.pdf

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