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CARNEIRO, N. P.

GOMES, E. A.

GUIMARAES, C. T.

JARDIM, S. N.

LANA, U. G. de P.

PINTO, A. C.

PURCINO, A. A. C.

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GENES INDUZIDOS POR TRATAMENTO COM CÁLCIO EM RAÍZES DO MILHO(Zea mays L.) SARACURA ‘BRS-4154’ EM CONDIÇÕES DE HIPOXIAAnne Cybelle Pinto1,  José Donizete Alves2, Newton Portilho Carneiro3, Eliane Aparecida Gomes4,Claudia Teixeira Guimarães3, Ubiraci Gomes de Paula Lana5, Sílvia Neto Jardim5 e Antônio ÁlvaroCorsetti Purcino3  (corsetti@cnpms.embrapa.br)IntroduçãoO alagamento e a submersão são fatores de estresses abióticos que afetam o desenvolvimento dasplantas e, juntamente com a seca, salinidade e altas temperaturas constituem os principaisdeterminantes para a distribuição das espécies vegetais no mundo (Visser et al., 2003). O alagamentoprovoca um ambiente hipóxico ou anóxico ao redor da raiz, que é o fator determinante dos seus efeitosadversos, uma vez que o oxigênio é o aceptor final de elétrons na rota de fosforilação oxidativa quegera ATP (Dennis et al., 2000). A anaerobiose resulta em alterações da expressão gênica em âmbitotranscricional, traducional e pós-traducional (Sachs et al., 1980) e muitos desses sinais são ativadospela elevação intracelular do cálcio (Mckinsey et al, 2002). Quando o canal de cálcio é bloqueado, osgenes induzidos por anoxia são reprimidos e a sobrevivência das plântulas e células em ambiente pós-anóxico fica comprometida (Subbaiah e Sachs, 2003). O milho ‘BRS-4154’ Saracura possui, comoprincipal característica agronômica, tolerância a períodos intermitentes de inundação do solo, e foilançada no mercado pela Embrapa Milho e Sorgo, por ter apresentado ganhos significativos naprodução de grãos, em condições de deficiência de oxigênio no solo (Parentoni et al., 1997). Comonenhum estudo na área molecular envolvendo esta variedade havia sido realizado, a estratégia dessetrabalho foi utilizar hibridização subtrativa e PCR supressivo na identificação dos genes expressos sobinfluência do cálcio sob condições de alagamento.Material e MétodosSementes do ciclo 14 de seleção massal, sob alagamento intermitente do milho Saracura, foramgerminadas e submetidas ao alagamento na presença ou não de cálcio (CaCl2) a 0,75% (p/v). Paradiminuir a pressão de oxigênio no tubo de germinação, tornando o ambiente hipóxico, fez-seborbulhamento com nitrogênio gasoso (3% v/v O2 em N2) por 3 minutos (1 L.min-1) e os tubos foramhermeticamente vedados. Após dois dias de estresse, o ápice primário da raiz (5 mm) e o materialrestante desse órgão foram coletados, separadamente, armazenados em nitrogênio líquido eposteriormente estocados a -80ºC. Os tratamentos foram ápice de raiz com cálcio, ápice de raiz semcálcio, raiz com cálcio e raiz sem cálcio. Para a extração do RNA mensageiro, utilizou-se o “KitQuickprep micro RNAm purification” (Amersham Biosciences), segundo as instruções do fabricante.                                                       1Bolsista MS/CNPq/Universidade Federal de Lavras; 2Professor/Universidade Federal de Lavras; 3Pesquisador/EmbrapaMilho e Sorgo; 4Técnico de Nível Superior/ Embrapa Milho e Sorgo; 5Estudante MS/Universidade Federal de Minas Gerais.As bibliotecas de cDNA foram obtidas com o PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit (ClontechLaboratories) conforme instruções do fabricante. Os produtos da segunda amplificação por PCR,obtidos das reações de subtração direta, foram clonados no vetor PCR 2.1 TOPO, utilizando-se o “KitTOPO TA Cloning for Sequencing” (Invitrogen). O DNA plasmidial foi extraído pelo método de lisealcalina e seqüenciado utilizando-se o “kit DYEnamic ET Dye Terminator” (Amershan Pharmacia).As seqüências foram processadas e comparadas com aquelas depositadas no banco de dados“Genbank” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando-se o programa BlastX (Altschul et al., 1997).Para verificar a presença desses clones, o DNA total do milho Saracura foi extraído e digerido comenzimas de restrição e transferido para membrana de náilon, de acordo com metodologia de Southern(1975). As membranas foram hibridadas com sondas marcadas com fosfatase alcalina e reveladas emautoradiografias.Resultados e DiscussãoPela análise visual, observou-se que as plântulas submetidas a quatro dias de germinação, sobinfluência de cálcio, apresentaram redução acentuada no crescimento em relação às plântulasgerminadas sem cálcio. As plântulas não apresentaram sinal de injúria neste período e sobreviveram a48 h de estresse. Utilizando a técnica de hibridização subtrativa e PCR supressivo, foi possível aidentificação de genes expressos diferencialmente sob hipoxia, influenciados pelo cálcio. Nabiblioteca do ápice primário da raiz, destaca-se a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que éessencial na resposta anaeróbica da planta para reposição de ATP pela rota glicolítica (Tabela 1).Dentre os clones provenientes de raiz, 13 clones foram gerados (Tabela 2), sendo que 5 estãoaparentemente relacionados a mecanismos fisiológicos de tolerância a estresses abióticos e a morteprogramada de células.Tabela 1- Clones advindos da biblioteca de ápice radicular de milho Saracura, submetido a hipoxiacom similaridade de seqüências no GenBankClone Descrição no banco de dados (GenBank) e-value Identidade ScoreA02 Ixodes ricinus glutationa S-transferase 3e-05 100% 56B04 Z. mays gliceraldeído-3-P desidrogenase 0,0 99% 1013C02 Dianthus caryophyllus provável proteína MtN3 2e-06 100% 60D06 Oryza sativa cultivar japonica DNA e-144 97% 517Tabela 2- Clones advindos da biblioteca de raiz de milho Saracura, submetido a hipoxia comsimilaridade de seqüências no GenBankClone Descrição no banco de dados (GenBank) e-value Identidade ScoreA03 Homo sapiens mioglobina 1e-35 97% 157A11 Zea mays PCO096382 RNAm 2e-39 90% 168B05 H. sapiens proteína-ligante FK506 3e-81 91% 309C12 H. sapiens basigina 2e-57 99% 228D11 H. sapiens paracaspase 0,0 99% 884D12 Z. mays PCO078539 RNAm e-173 95% 617E04 H. sapiens dineína e-120 99% 438E10 H. sapiens basigina 1e-62 98% 246E12 Z. mays PCO078539 RNAm 0,0 97% 728F01 H. sapiens basigina 3e-69 100% 268G11 H. sapiens paracaspase 0,0 98% 848H02 Z. mays parviglumis seqüência DNA 1e-21 100% 109H12 H. sapiens mioglobina 2e-39 98% 168A mioglobina possui regiões muito similares à cadeia polipeptídica da hemoglobina, proteína detransporte de oxigênio (Dordas et al., 2003). Assim, a mioglobina provavelmente transporta oxigêniopara a mitocôndria, uma vez que se trata de um ambiente de baixa pressão de oxigênio e, sob estacondição, não ocorre inibição total da respiração aeróbica. A dineína atua provavelmente ativando oscanais de cálcio ou no recrutamento de organelas que acumulam cálcio, para locais que maisnecessitam deste elemento (Thion et al., 1996). A paracaspase faz parte da rota de morte celularprogramada (Ameisen, 2002), promovendo, por exemplo, a formação de aerênquima que facilita apara difusão do oxigênio. A proteína-ligante FK506 é um possível receptor de hormônio que atua natranscrição de genes ou atua na via de transdução de sinal (Pérez-Pérez et al., 2004). Finalmente, abasigina é uma glicoproteína transmembrana que faz parte da constituição do complexo do poronuclear (Yoshida et al., 2000). Este complexo permite a passagem de proteínas do citossol para onúcleo e vice-versa, atuando na transcrição de genes. Dentre os clones provenientes do ápice primárioda raiz, destaca-se a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, proteína sintetizada na raiz durantecondições anóxicas e conhecida como polipeptídeo anaeróbico (Manjunath & Sachs, 1997). Essaproteína é requerida para continuidade da glicólise, tornando-se essencial na resposta anaeróbica pelaplanta para reposição de ATP pela rota glicolítica. De alguma forma, todas as proteínas estãorelacionadas e atuam na tentativa de promover uma maior sobrevivência da plântula sob condições dehipoxia, influenciado pelo cálcio. Além desses genes de função conhecida, alguns clones foramsimilares a genes sem função conhecida ou não tiveram similaridade com nenhuma seqüênciadepositada no GenBank. Estes podem ser genes importantes que atuam na maior sobrevivência daplanta ao estresse hipóxico influenciado pelo cálcio. Como alguns clones advindos da raiz do milhoSaracura apresentaram identidade com genes humanos, a presença dos mesmos no genoma do milhofoi confirmada por meio de “Sourthern-blot”. Para isso foram utilizados como sonda, cinco cDNAsprovenientes de raiz, que apresentaram identidade com mioglobina, dineína, basigina, paracaspase eproteína ligante FK506. Como controle positivo, utilizou-se a sonda gliceraldeido-3-fosfatodesidrogenase do milho, presente no material proveniente do ápice radicular. A Figura 1 mostra aprovável relação entre as proteínas encontradas na biblioteca de raiz de plântulas de milho submetidasa hipoxia sob a influência do cálcio.Figura 1. Representação da provável relação entre as proteínas codificadas pelos genes advindos dabiblioteca subtrativa das raízes de plântulas de milho submetidas a hipoxia sob influência do cálcio.ConclusõesUma vez confirmada a superexpressão desses genes sob as condições de alagamento, maioresconclusões poderão ser inferidas sobre o efeito do cálcio nos mecanismos fisiológicos e molecularesenvolvidos na tolerância a esse estresse. Além do que esses genes poderão ser transferidos para outraslinhagens elites de milho e incorporadas nos programas de melhoramento genético.Referências BibliográficasALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T.L.; SCHÄFFER, A.A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.LIPMAN, D.J.  Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searchprograms, Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389-3402, 1997.AMEISEN, J. C. Origin and evolution of programmed cell death. Cell Death Differentiation,London, v. 9, n. 4, p. 367-393, 2002.DENNIS, E. 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Genes induzidos por tratamento com cálcio em raízes do milho (Zea mays L.) Saracura "BRS-4154" em condições de hipoxia.

Genes unduzidos por tratamento com cálcio em raízes do milho (Zea mays L.) Saracura "BRS-4154" em condições de hipoxia.

Genes unduzidos por tratamento com cálcio em raízes do milho (Zea mays L.) Saracura "BRS-4154" em condições de hipoxia.

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