Este trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética através de marcadores moleculares SSR em uma amostra de variedades tradicionais oriundas de coletas, conduzidas entre os anos de 1978 e 1996, em lavouras de pequenos agricultores no Brasil

BORBA, T. C. de O.

BRONDANI, C.

BRONDANI, R. V.

MAGALHÃES, M. R.

RANGEL, P. H. N.

ZUCCHI, M. I.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Análise da variabilidade genética de variedades tradicionais de arroz (Oryza sativa L.) através de marcadores moleculares microssatélites.

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ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE VARIEDADES TRADICIONAIS DE ARROZ (Oryza sativa L.) ATRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES MICROSSATÉLITES 1  Tereza Cristina de Oliveira Borba 2, Maria Imaculada Zucchi 3, Rosana Vianello Brondani 4, Paulo Hideo Nakano Rangel4, Mara Rúbia Magalhães, Claudio Brondani4  Palavras-Chave: Recursos genéticos, Coleção nuclear, base genética, produtividade.  INTRODUÇÃO O Brasil produz anualmente, aproximadamente 11,5 milhões de toneladas de arroz, quantidade muito próxima de seu consumo interno. Instabilidade climática e ocorrência de doenças tem ocasionado queda na produção, e a conseqüente necessidade de importação deste cereal. Se considerarmos ainda o aumento da população a uma taxa de 2% ao ano, conclui-se que há necessidade de se procurar novas alternativas para aumentar a produção brasileira de arroz, apenas para suprir o mercado interno. A principal causa apontada para a estagnação dos patamares de produtividade é a utilização de genitores aparentados no programa de melhoramento genético (Rangel et al., 1994), o que tem reduzido as chances de aparecimento de novas combinações gênicas favoráveis para características relacionadas a produção. Deste modo, o uso de parentais geneticamente divergentes em cruzamentos, poderia favorecer o desenvolvimento de linhagens com elevado potencial produtivo e com base genética mais ampla. Este trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética através de marcadores moleculares SSR em uma amostra de variedades tradicionais oriundas de coletas, conduzidas entre os anos de 1978 e 1996, em lavouras de pequenos agricultores no Brasil.   MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal: foram analisados 192 acessos de arroz oriundos de expedições de coleta realizadas em vários estados do Brasil, durante o período de 1978 a 1996 (Tabela 1). Os genótipos foram selecionados com base nos nomes idênticos, que apresentavam em diversos locais de coleta. O DNA de cada acesso foi obtido de um grupo de 10 indivíduos, reunidos em bulk, ou seja analisou-se uma amostra que continha o DNA de 10 plantas por acesso.                                                  1 Pesquisa em desenvolvimento com suporte financeiro do CNPq e Embrapa Arroz e Feijão 2 Bolsista do CNPq. Embrapa Arroz e Feijão. E-mail: oliveiraborba@yahoo.com.br 3 Estudante de Doutorado da ESALQ-USP. E-mail: mizucchi@carpa.ciagri.usp.br4 Pesquisadores da Embrapa Arroz e Feijão. caixa Postal 179, CEP 75375-000, Santo Antônio de Goiás, GO. Email: rosanavb@cnpaf.embrapa.br ; brondani@cnpaf.embrapa.br ; phrangel@cnpaf.embrapa.br  Análise com marcadores SSR: Cada reação de volume final de 15 µL continha: 3,55 µL de H2O estéril, 1,5 µL de tampão 10x, 1,3 µL de dNTP (2,5 mM), 1,3 µL de DMSO (50%), 2,15 µL de primer (0,9 µM), 0,2 µL de enzima Taq polimerase (5 unidades/ µL) e 5 µL de DNA (3ng/ µL). As reações foram conduzidas no termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizando o seguinte perfil de temperaturas: 94°C/ 5 minutos, 29 ciclos de 94°C/ 1 minuto, 56°C/ 1 minuto, 72°C/ 1 minuto, e 72°C/ 7 minutos. O produto da reação de SSR foi submetido a eletroforese em gel de acrilamida 4% corada com nitrato de prata. Marcadores Moleculares utilizados: Inicialmente foram avaliados 28 marcadores microssatélites altamente informativos (heterozigosidade esperada maior que 80%), em uma amostra formada por 4 acessos de arroz. Destes, foram selecionados 12 marcadores SSR para análise dos 192 acessos, baseados no seu polimorfismo e localização cromossômica (um marcador para cada cromossomo): RM9, RM11, RM22, RM 204, RM207, RM223, RM229, RM247, RM252, RM310 (Chen et al., 1997), e OG61, OG106 (Brondani et al., 2001). A partir do número e freqüência de alelos, foram estimados o número de alelos restritos de cada acesso, a heterozigosidade observada (Ho) e a diversidade gênica (He), a matriz de distância genética e o dendrograma baseado nesta matriz. Para estas análises foram utilizados os softwares GDA, TFPGA, FSTAT e NTSYS.  RESULTADOS E DISCUSSÃO Os 12 locos SSR selecionados revelaram 175 alelos para os 192 acessos analisados. O número de alelos por loco variou de 6 (RM 22, Figura 1) a 22 alelos (OG 61 e OG 106), com uma média de 14,6  alelos por loco.  Como medida do potencial informativo dos marcadores microssatélites, calculou-se o índice de heterozigosidade esperada (PIC – “Polymorphism Information Content”), o qual variou entre 0,33 (RM 252) e 0,94 (OG 106), sendo o valor médio encontrado de 0,73 (Tabela 2). Os valores da heterozigosidade esperada (He) foram maiores que os da heterozigosidade observada (Ho), indicando um excesso de homozigotos, conforme o esperado para uma espécie de hábito reprodutivo preferencialmente autógamo como o arroz.  Para os acessos que apresentaram bulks em heterozigose para 4 ou mais marcadores SSR (Tabela 3), os 10 indivíduos componentes do bulk foram analisados individualmente com estes marcadores, a fim de verificar a segregação alélica dentro de cada acesso. Desta forma, a análise molecular foi restringida aos acessos geneticamente mais variáveis. Da mesma forma, os indivíduos pertencentes a bulks de acessos que apresentaram 3 alelos por loco SSR  também foram genotipados.   Tabela 1- Local de coleta e nome comum das 192 variedades tradicionais de arroz analisadas. Nome Comum Unidade Federativa Nome Comum Unidade Federativa Nome Comum Unidade Federativa Nome Comum Unidade Federativa 3 Meses GO Bico Torto RS Cutião PI Meruim II AC 3 Meses Amarelo GO Boliviano MT Cutião Vermelho MA Mineiro AC 3 Meses Curto MG Branco GO De Maio MS Miúdo Branco MA 3 Meses Precoce GO Branco 3 Meses MG De Morro ES Montanha AM 4 Meses GO Branco 4 Meses GO Dez Anos MT Montanha Potrão MS 4 Meses Antigo MT Branco Longo Precoce SP Doidão ES Mucuim PI 60 Dias GO Branquinho BA Douradão GO Muruim AM 90 Dias AL Brejeiro MG Douradinho AC Nanicão ES 100 Dias GO Brejeiro MG Escrevim PI Neném MA Abril RJ Buriti PI Farroupilha RS Nenezinho Branco MA Agulha CE Buriti Vermelho MA Ferrão Preto GO Noventinha MS Agulha MT Cacho Grande MT Ferrão Preto Precoce SP Pacholinha RJ Agulha MT Caiana Grande AL Ferrugem  MT Paga Dívida PI Agulha Amarelo AM Cana Roxa GO Ferrujão MS Palha Murcha PI Agulha Vermelho CE Cana Roxa Vermelha MA Goianinho MS Patrão RO Agulhão AL Canela de  Aço AC Goiano MA Paulista AC Agulhão RR Canela de Ferro AC Grão de Ouro GO Peludo GO Agulhão RO Carijó GO Guaira GO Pindorama GO Agulhão RO Carioca RJ Guaira Amarelo GO Pingo de Ouro PI Agulhinha AC Carioquinha GO Guaira Branco GO Prata CE Agulhinha Amarelo MS Carioquinha Amarelo GO Guapa RO Prata Ligeiro CE Agulhinha Anão RO Carioquinha Areia GO IAC  Produtor MS Prata Roxa MG Agulhinha do Paraguai MT Carioquinha Vermelho GO IAC 1246 RO Pratão MT Agulhinha Vermelho RR Carolina PI IAC 47 MS Pratão RO Amarelão MS Carolina Bico Preto MS IAC 25 Branco PI Pratão MT Amarelão 90 Dias MS Carolina Longo MS Iguapé GO Pratão 4 Meses AM Amarelão Bico Preto AM Casado MA IR-8 PI Pratão Precoce GO Amarelão Bico Preto 3 Meses MT Casado Ligeiro PI IR 8 do Padre PI Pratinha GO Amarelão Precoce SP Casca Branca MG Jaguari AM Precoce BA Amarelinho GO Catetão MT Japonês RS Preto RO Amarelo AM Catetinho MG Japonês CE Rabo de Carneiro GO Amarelo Bico Preto GO Cateto MT Japonês Claro RO Samambaia ES Amarelo Branco SC Cateto Amarelo PR Lageado PI Saquarema PI Amarelo Precoce SP Cateto Bico Preto SP Ligeirinho PI Serra Azul MG Anão CE Cateto Seda SP Ligeiro MA Sta América MT Anão AL Chatão AM Ligeiro Vermelho PI Sta América GO Anãozinho TO Chatão Vermelho AM Macaba Ligeiro PI Talo Roxo PB Bacaba PI Chatinho AL Macaba Maranhense PI Tomba Morro MG Bambu RO Chatinho Branco SE Macaba Miúdo PI Toro PB Barriga Branca MG Chifre de Veado MS Macapa PI Venez Branco ou Prata MG Batatais PR Chorinho MG Mangote RJ Vermelhão Taiano RR Beira Campo MT Chorinho Americano MG Maranhão PI Vermelhinho PI Bico Ganga GO Chorinho Apículo Escuro MG Maranhão Branco PI Vermelhinho 3 Meses MT Bico Preto AC Come Cru RR Maranhense PI Vermelho AC Bico Preto Cana Roxa MS Come Cru PI Matão MG Zebu PI Bico Preto Roxo MA Come Cru Branco MA Mato Grosso PI Zebu Branco MA Bico Roxo BA Comprido GO Meruim AC Zebu Ligeiro PI Bico Roxo Branco GO Comum GO Meruim Dourado CE Zebu Pingo d'água RR   Figura 1 – Padrão de amplificação do marcador RM 22 para os 192 acessos de Oryza sativa. Linha superior: acessos 1 a 96, linha inferior: acessos 97 a 192. Marcador de peso molecular: Ladder 10 pb.   Tabela 2 – Estimativas de parâmetros genéticos de diversidade em 192 acessos de Oryza sativa, utilizando marcadores microssatélites: número de alelos; eH (heterozigosidade esperada) e 0H  (heterozigosidade observada). Marcador SSR N° de alelos He Ho RM 9 17 0,8217 0,0250 RM 11 14 0,6199 0,0568 RM 22 6 0,6006 0,0286 RM 204 17 0,5418 0,0404 RM 207 14 0,7533 0,0313 RM 223 10 0,8158 0,0605 RM 229 9 0,7943 0,0156 RM 247 17 0,8321 0,0094 RM 252 11 0,3340 0,0132 RM 304 16 0,8620 0,0069 OG 61 22 0,8872 0,0603 OG 106 22 0,9390 0,0748 Média 14,58 0,733 0,035 O dendrograma foi obtido a partir dos  dados da matriz de distância genética J&C (Jukes & Cantor, 1969), que apresentou o maior índice de correlação cofenética (0,78) em comparação a outros coeficientes de distância genética utilizados. Nenhum dos acessos com mesmo nome comum, oriundos de diferentes Estados, foram geneticamente idênticos. Isto foi devido a grande variação encontrada dentro dos acessos, mesmo utilizando apenas uma amostra de 10 indivíduos, que constituíram os bulks. Esta diferença pode ser decorrente de um processo que pode incluir mistura de sementes e fecundação cruzada com outras cultivares plantadas em áreas adjacentes. Este processo, submetido à seleção local após vários anos de cultivo, pode fornecer uma nova identidade a uma variedade tradicional, geneticamente divergente da variedade que possua o mesmo nome, e que   esteja sendo cultivada em outro ambiente. Assim, mesmo o Brasil não sendo o centro de origem da espécie O. sativa, as condições ambientais locais podem ser fatores importantes para determinar o grau de variabilidade genética entre acessos de arroz coletados, o que corrobora a utilização de dados geográficos como critério para montagem da coleção nuclear do arroz (Abadie et al., 2001). As maiores distâncias genéticas encontradas foram 0,218 entre os acessos 60 dias e Goiano, e 0,203 entre os acessos 60 dias e Come Cru Branco. A distância média encontrada entre os 192 acessos foi de 0,115, superior à distância média encontrada de 0,08, obtida entre 43 cultivares comerciais de arroz (dados não publicados), ou seja, variedades tradicionais ainda mantém variabilidade genética suficiente para viabilizar sua utilização no programa de melhoramento visando a ampliação da base genética de novas cultivares de arroz. No dendrograma, foram identificados acessos com nomes distintos, mas geneticamente semelhantes (Figura 2A), assim como indivíduos que compunham o mesmo bulk sendo geneticamente distintos (Figura 2B).   Tabela 3 – Bulk aberto para os acessos que apresentaram heterozigose para 4 ou mais locos SSRs ou 3 alelos por loco.  Acessos Loco SSR Agulha RM 204, RM 207, RM 223, RM 229, RM 247, RM 252, OG 61 Bico Preto* RM 11, RM 223, RM 252, OG 61, OG 106 Chatinho RM9, RM 207, RM229, RM 247, RM 252  Chorinho* RM 247, OG 61, OG 106 Come Cru Branco RM 9, RM 11, OG 61, OG 106 De Maio RM 11, RM 207, RM 223, RM 252 Doidão* RM 207, RM 223 Japonês Claro RM 9, RM 11, RM 304, OG 106 Macaba Marenhense RM 9, RM 11, RM 22, RM 223, OG 106 Mato Grosso RM 22, RM 207, OG 61, OG 106 Meruim II RM 9, RM 11, RM 22, RM 223, RM 229 Japonês RM 11, RM 207, RM 229, RM 247, RM 252, OG 61, OG 106 Prata Roxa* RM 207, RM 229, RM 247, RM 252, RM 304, OG 61, OG 106 Agulhão RM 9, RM 207, RM 223, OG 106 Serra Azul RM 9, RM 11, RM 223 Venez Branco ou Prata* RM 11, RM 207, RM 229, RM 247, RM 252, OG 61, OG 106 (*) Acessos com 3 alelos por loco.              Figura 2 - Dois fragmentos do dendrograma construído com 192 acessos de arroz baseado na distância genética utilizando o coeficiente J&C para 12 marcadores SSRs. A) Exemplo de acessos com nomes diferentes e geneticamente idênticos; B) Exemplo de acessos pertencentes ao mesmo bulk, com grau variável de diversidade genética.  CONCLUSÕES 1) Variedades tradicionais devem ser utilizadas como genitores do programa de melhoramento do arroz, por representarem um grupo de genótipos adaptados as mais variadas condições ambientais brasileiras, e por serem fontes de variabilidade genética para o melhoramento.  2) O nome comum não é um bom descritor da identidade e variabilidade genética de variedades tradicionais.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABADIE, T.E., CORDEIRO, C.M.T., FONSECA, J.R., FREIRE, M.S., ALVES, R.B.N., BURLE, M.L., BRONDANI, C., RANGEL, P.H.N., CASTRO, E. DA M., SILVA, H.T. 2001. Desenvolvendo uma coleção nuclear de arroz para o Brasil. In: Anais da VII Reunião Nacional de Pesquisa de Arroz. Embrapa, Santo Antônio de Goiás. p. 259-261.  BRONDANI, C., BRONDANI, R.P.V., RANGEL, P.H.N., FERREIRA, M.E. 2001. Development and mapping of Oryza glumaepatula-derived microsatellite markers in the interspecific cross O. glumaepatula x O. sativa. Hereditas. 134: 59-71.  CHEN, X., TEMNYKH, S., XU, Y., CHO Y.G., MACCOUCH, S. R. 1997. Development of a microsatellite framework map providing genome-wide coverage in rice (Oryza sativa L). Theoretical and Applied Genetics 95: 553-567.    JUKES, T.H. & CANTOR, C.R. 1969. Evolution in protein molecules. In: Munro, H.N. (Ed.) Mammalian Protein Metabolism. Academic Press. New York., p.21-123.  RANGEL, P.H.N., GUIMARÃES, E.P., NEVES, P.C.F. 1994. Base genética das cultivares de arroz (Oryza sativa L.) irrigado do Brasil. Pesquisa Agropecuária Brasileira. 31: 349-357. 

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/936126/1/T225.pdf

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