BARBOSA, N. A.

OLIVEIRA, M. G. de A.

PAES, M. C. D.

PIRES, C. V.

SANT'ANA, R. de C. O.

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Novo Método de Extração de Zeina utilizando Agente Redutor Não TóxicoRita de Cássia Oliveira Sant’ Ana1, Maria Cristina Dias Paes2, Natália Alves Barbosa3,Christiano Vieira Pires4, Maria Goreti de Almeida Oliveira51,5Dep. De Bioquímica e Biologia, UFV, Viçosa, MG, ritasant_ana@yahoo.com.br;2Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, mcdpaes@cnpms.embrapa.br,3Departamento Ciências dos Alimentos. Universidade Federal de Lavras – UFLA,nataliaalvesb@yahoo.com.br; 4Universidade Federal de São João Del-Rei, Campus de Sete Lagoas, christiano@ufsj.edu.brRESUMO – Zeinas são proteínas de reserva do grão de milho, solúvel em soluçãoalcoolica que representam mais de 50% das proteínas totais do grão. Sua extração comercial é feita a partir do glúten de milho, um subproduto do processamento damoagem via úmida utilizada na fabricação do amido de milho. Quatro tipos de zeinas, • ,• , • e •, já foram identificadas, sendo essas distintas na sequencia de aminoácidos, solubilidade, ponto isoelétrico e composição polipeptídica. Solução aquosa de álcool éutilizada para extrair • -zeina diretamente de grãos moídos de milho ao passo que a extração das demais frações requer a presença de agente redutor na solução. Isso limita o uso direto de filmes e coberturas de zeinas nos alimentos. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um novo procedimento para isolamento de zeina a partir de grãos moídos de milho utilizando um agente redutor não tóxico. Quatro métodos diferentes de isolamento foram testados, três já publicados na literatura e um novométodo com o agente redutor não tóxico. A caracterização das frações de proteína extraídas foi realizada por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). O perfil eletroforético das prolaminas do milho revelou a presença de quatro frações de zeina nos materiais extraídos na presença de agente redutor, sem nenhuma diferença de padrãoeletroforético entre os isolados obtidos com agente redutor não tóxico e o tóxico. Sendoassim, a substituição de um agente redutor tóxico na extração de zeinas pode ser uma alternativa para estender o uso de zeina diretamente na produção de biofilmes para a finalidade de uso alimentar e  revestimento de medicamentos de uso oral.Palavras-chave: Milho, zeina, extração, agente redutor não tóxicoIntroduçãoAs prolaminas, proteínas ricas nos aminoácidos prolina e glutamina, são asprincipais proteínas de armazenamento da maioria das sementes dos cereais (SHEWRYet al., 1999). No milho as prolaminas são denominadas zeinas e correspondem a cercade 70% das proteínas do endosperma do milho convencional (BICUDO et al, 2006; SCRAMIN et al, 2007), podendo ser definidas como proteínas de reserva(WANG e PÁDUA, 2005). Três grupos estruturalmente distintos, nomeados de • , • e •-zeina, foramclassificados de acordo com uma nomenclatura amplamente aceita (ESEN, 1986). Um quarto grupo compreendendo duas proteínas, a • -zeina de 10 kDa (KIRIHARA et al., 1988) e a • -zeina de 18 kDa (WOO et al., 2001) foi depois adicionado à familia das XXIX CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO - Águas de Lindóia - 26 a 30 de Agosto de 20123619prolaminas do milho. Tais proteínaszeina diferem entre si pela sequencia de aminoácidos, características de solubilidade, ponto isoelétrico e composiçãopolipeptídica (ESEN, 1986; SHEWRY e TATHAM, 1990).As • -zeinas são caracterizadas por duas bandas 19KDa e 22KDa, naeletroforese em gel contendo dodecil sulfato de sódio (SDS/PAGE); sendo similares em sequência e solubilidade, diferindo apenas no tamanho. Tais proteínas, que constituem de 75 a 85% das zeinas totais, são ricas em resíduos de aminoácidos apolares e são, portanto, insolúveis em água e solúveis em soluções aquosas de etanol a 70% (BICUDO et al, 2006; FORATO, 2000). Por sua vez, • -zeina corresponde às bandas de 14 e 16 kDa, representam de 10 a 15% da fração total e são solúveis em álcool hidratado após uso de agentes redutores. Já a •-zeina apresenta banda em 28 kDa na eletroforese, representa de 5 a 10% das zeinas totais e, para solubilização dessa proteína, tanto em álcool 70% como em água, é necessário o uso de agentes redutores para rompimentodas ligações dissulfeto. Por fim, a • -zeina equivale à banda de 10 kDa e representa somente traços da fração total de zeinas; assim como as zeinas • , • , são extraídassomente com redução das ligações de dissulfeto (BICUDO et al, 2006; SHEWRY et al, 1990), sendo usado tradicionalmente o beta mercaptoetanol (ESEN, 1986).Zeina é uma das proteínas mais hidrofóbicas de cereais, apresentandohidrofobicidade média de 1,365 J/mol. A alta proporção de resíduos de aminoácidos nãopolar é o responsável pela hidrofobicidade da zeina. A ordem de hidrofobicidade das frações de zeina é maior para •  e • -zeinas r do que •  zeina, a qual é apresenta maior hidrofobicidade que • -zeina (HOLDING e LARKINS, 2009).Esse grupo de proteínas foi isolado pela primeira vez por Gorham (1821) em milho integral usando solução aquosa de etanol e a primeira patente para o método comercial de extração de zeina foi concedida a Osborne (1891). Desde então, diferentes procedimentos utilizando diferentes solventes para extrair as proteínas dos cereais sãorelatados na literatura, nos quais fatores como concentração e tipo de solvente, temperatura e tempo da extração variam com o intuito de aumentar a eficiência do processo. O método usado para isolar as proteínas tem efeitos importantes nas suas propriedades (AGBOOLA e MILLS, 2005). A extração da zeina pode ser feita a partir de todos os co-produtos do milho, mas a zeina comercial é normalmente produzida a partir do glúten de milho. A maioria das extrações da prolamina do milho tem sido baseada em extração por solução aquosa de etanol, mas muitos outros solventes podem solubilizar a zeina. Sistemas de extração 3620de zeina tem sido otimizados para diferentes produtos e co-produtos do milho devido às diferenças nas concentrações de proteína e as condições de processamento (ANDERSON e LAMSAL, 2011).O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um novo procedimento deisolamento de zeina com o uso de agente redutor não tóxico, comparando-o aos já reportados na literatura.Material e MétodosO presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Qualidade de Grãos doCentro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo da Embrapa, situado em Sete Lagoas –MG e no Laboratório de Enzimologia, Bioquímica de Proteínas e Peptídeos do Institutode Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em Viçosa - MG.Para a análise dos métodos de extração de zeinas, foi utilizada amostra moídade grãos do cultivar de milho BRS1060. A moagem foi realizada em moinho cicloneutilizando peneira de 0,5mm. Após a moagem, a amostra foi mantida em freezer até a realização das análises.Foram testados quatro métodos diferentes para o isolamento da zeina, sendo três já reportados na literatura (FORATO et al, 2008; HAMAKER et al, 1995; LANDRY et al, 2000) e um novo método, que substitui o agente redutor convencional beta-mercaptoetanol, por um outro agente redutor não tóxico.A caracterização das frações de proteínas foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).Para a identificação das proteínas presentes nas amostras, foram utilizados padrões de peso molecular da Fermentas Life Sciences (Unstained Protein Molecular WeightMarker) contendo sete proteínas com pesos moleculares de 14.4 a 116.0kDa.. Os géis foram fotodocumentados e as imagens obtidas foram analisadas.Resultados e DiscussãoOs perfis proteicos obtidos após extração das zeinas podem ser observados na Figura 1, que representa a foto do gel com as devidas marcações quanto ao peso molecular das bandas proteicas do padrão utilizado e as bandas correspondentes a cadasubunidade da zeina. A imagem do gel permitiu observar que a solução de etanol 70% adicionado do agente redutor não tóxico (Novo Método) permitiu extrair as quatro 3621frações de zeinas presentes no milho, sendo • - zeina-(PM = 19 e 22 kDa), • -zeina (PM= 14 kDa), •-zeina (PM =  27 kDa) e • -zeina (PM = 10 kDa) (ESEN, 1986). Essepadrão eletroforético não diferiu daqueles das zeinas extraídas com os demais métodos utilizando o agente redutor beta mercaptoetanol.Figura 1: Mini gel (SDS/PAGE) de zeinas extraídas por diferentes métodos. Gel de empilhamento 6% e gel de separação 15% acrilamida - bis acrilamida. Corrida inicial a20mA (atingir o gel de separação) e depois a 30mA, mantendo a voltagem constante no valor máximo. Volume aplicado/fosso = 5µL. Padrão de peso molecular UnstainedProtein Molecular Weight Marker (Fermentas Life Sciences) = 10µL. Coloração comprata.ConclusãoA substituição do agente redutor beta mercaptoetanol por outro agente redutor não tóxico na extração de prolaminas de milho pode ser uma alternativa para utilizaçãoda zeina diretamente na produção de coberturas e biofilmes com finalidade derevestimento de alimentos.APOIO FINANCEIRO: FAPEMIG e CNPq.Marcador   Comercial     Novo Método   Hamaker Landry I Landry II       Forato25,0 KDa116,0 KDa18,4 KDa14,4 KDa35,0 KDa45,0 KDa66,2 KDa• -zeina• -zeina3622Literatura CitadaAGBOOLA, S.; NG, D.; MILLS, D. Characterization and functional properties ofAustralian rice protein isolates. Journal of. Cereal Science, v. 41, p. 283-290, 2005. ANDERSON, T. J., and LAMSAL, B. P.. Zein Extraction from Corn, Corn Products, and Coproducts and Modifications for Various Applications: A Review. CerealChemistry, 88(2), 159-173, 2011.BICUDO, R. C. et al. Análise de zeinas •  do milho por LC-ESI-Q/TOF. Comunicadotécnico 77 - EMBRAPA. São Carlos, SP. Nov., 2006.ESEN, A.. Separation of alcohol-soluble proteins (zeins) from maize into three fractions by differential solubility. Plant Physiology. 80:623-627, 1986.FORATO, L. A. Estudo das estruturas das zeinas por RMN, FTIR e MFA. 2000.Tese (Doutorado) Instituto de Química de São Carlos, USP, São Carlos.GORHAM, J. Analysis of Indian corn. Quarterly Journal of Science, Literature and the Arts. 2:206-208, 1821.HAMAKER, B. R., MOHAMED, A. A., HABBEN, J. E., HUANG, C. P., and LARKINS, B. A. Efficient procedure for extracting maize and sorghum kernel proteins reveals higher prolamin contents than the conventional method. Cereal Chemistry.72:583-588, 1995.HOLDING, D.R., LARKINS, B.A. Zein storage proteins. In: Kriz, A.L., Larkins, B.A.(Eds.), Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement, vol. 63. Springer, Berlin Heidelberg, pp. 269e286, 2009.KIRIHARA, J.A., PETRI, J.B. & MESSING, J. Isolation and sequence of a gene encoding a methionine-rich 10-kDa zein protein from maize. Gene, 71, 359-370, 1988.LANDRY, J., DELHAYE, S., and DAMERVAL, C. Comparative efficiencies ofisopropyl and tert-butyl alcohols for extracting zeins from maize endosperm. TheJournal of Agricultural and Food Chemistry 50:4131-4134, 2002.OSBORNE, T. Process of extracting zein. US patent 456,773, 1891.SCRAMIN, J. A. et al. Caracterização da ação protetora de filmes à base de zeinas eácido oleico aplicados em maçãs in natura. São Carlos, SP: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2007. (Circular Técnica 37).SHEWRY PR. The synthesis, processing and deposition of gluten proteins in the developing wheat grain. Cereal Foods World 44, 587–589, 1999.SHEWRY, P.R.; MILES, M.J.; TATHAM, A.S. 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Novo método de extração de zeina utilizando agente redutor não tóxico.

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