BELLAVER, F. A. V.

CARON, L.

KLEIN, C. S.

MORES, M. A. Z.

MORES, N.

REBELATTO, R.

SILVA, G. B. da

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JINC – 6ª Jornada de Iniciação Científica Embrapa SIPEX – II Seminário de Pesquisa e Extensão da UnC 25 de outubro de 2012 – Concórdia/SC 20  PRODUÇÃO DE SORO HIPERIMUNE PARA DETECÇÃO DE PASTEURELLA MULTOCIDA  Silva, G. B. da1*; Caron, L.²; Mores, N.²; Mores, M. A. Z.²; Klein C. S.2; Rebelatto, R.2;  Bellaver, F. A. V. 1*Graduando em Ciências Biológicas pela Universidade do Contestado, Campus Concórdia, Estagiário da Embrapa Suínos e Aves, Bolsista CNPq/ PIBIC. e-mail: gilneibrunosilva@hotmail.com 2Embrapa Suínos e Aves, Caixa postal 21, Vila Tamanduá, 89700-000 Concórdia SC  Palavras-chave: Imunotestes, ovinos, soro hiperimune.  Introdução A Pasteurella multocida (Pm) e pode estar presente em processos pneumônicos e pleurisias em suínos. Geralmente a produção dos soros hiperimunes é feita por meio da inoculação do microorganismo a ser pesquisado em animais específicos como coelhos obtendo-se uma resposta do sistema imune com a produção de anticorpos. Essa resposta é monitorada por técnicas de imunotestes como, a imunodifusão, soroaglutinação em lâmina de microscopia, ELISA entre outras.  Assim, no presente trabalho, foram inoculados ovinos com antígeno de Pm, objetivando a produção de soro hiperimune e posterior utilização em testes de imuno-histo-química (IHQ) para detecção de Pm.  Material e Métodos Identificação da amostra: Foi utilizada uma cepa de Pm tipo A (nº 11246), da Embrapa Suínos e Aves (CNPSA). Cultivo e inativação da amostra: Foram cultivados 25uL da amostra por 24h a 37°C em 250mL de meio de cultivo Trypticase Soy Broth (TSB). Após, foram adicionado 300uL de formaldeído P.A, sendo o material incubado a 37ºC por mais 24h para inativação da Pm.  Produção do Ag: O cultivo inativado foi centrifugado a 10000g/45minutos para obtenção de um pellet. Posteriormente, foram realizadas três lavagens e novas centrifugações do pellet com Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,2 a 12000rpm/30minutos. O pellet foi então dissolvido em 25ml de PBS pH7,2 com timerosal (0,2g/L)  e  armazenado a uma  temperatura entre 4º a 8ºC. A concentração do antígeno foi ajustada em espectrofotômetro para transmitância de 37%. Esquema de inoculação de ovinos: O antígeno inativado foi administrado por via intramuscular em 02 ovinos, conforme descrito na tabela 1. Teste de aglutinação rápida (AR): A técnica de AR foi executada conforme descrito no Manual Bergey’s, 1994 (1). Sendo o resultado positivo caracterizado pela presença de grumos. Teste de aglutinação lenta em tubo (AL): Tal técnica foi realizada conforme descrito no Manual Bergey’s, 1994 (1).  Sendo o resultado positivo caracterizado pela presença de precipitado no fundo do tubo e sobrenadante límpido. Os resultados negativos são caracterizados por turvação uniforme dos tubos. O título é expresso em função do último tubo com reação positiva. Técnica de Imunodifusão em Gel de Agarose (IGA): Técnica realizada conforme descrito por Turni e Blackall, 2005 (3). Sendo a reação positiva caracterizada por formação de linha de precipitação correspondente a reação antígeno-anticorpo.  Técnica de IHQ: Com o soro hiperimune produzido e testado, utilizando as técnicas citadas acima, foi realizada a técnica de IHQ para Pm padronizada no CNPSA.  Tab. 1. Esquema de inoculação de ovinos. Dose Intervalo Via Volume Inóculo 1 Dia zero SC 1mL Ag 2 3º dia SC 1mL Ag 3 5º dia SC 1mL Ag 4 10º dia IM 2mL Ag+AlOH 5 15º dia IM 2mL Ag+AlOH 6 30º dia IM 1mL Ag+ Freund´s inc. 7 45º dia IM 1mL Ag+ Freund´s inc. 8 75º dia IM 1mL Ag+ Freund´s inc. Onde: SC)Subcutâneo; IM) Intramuscular;  Ag) Antígeno;  inc) Incompleto  Resultados e Discussão Observando os resultados dos imunotestes, que estão demonstrados na Tabela 2, é possível inferir que só houve resposta imune dos ovinos a partir das inoculações de Ag com adjuvante incompleto de Freund´s. Assim, recomendamos o ajuste do protocolo do desafio, eliminando as inoculações com Ag inativado complexado ao adjuvante AlOH, que foram descritas na Tabela 1. Ainda, a Pm foi detectada por IHQ utilizando o soro produzido.  Tab. 2. Resultados dos imunotestes. Entre parêntesis o título de anticorpos detectado. Coletas Ovino_2673 Ovino_2674 AR AL IGA AR AL IGA A N N N N N N  B P P (1:80) P P P (1:160) P C P P (1:160) P P P (1:160) P Onde: N_Negativo;  P) Positivo; A) Anterior a 6ª inoculação; B) Anterior a 8ª inoculação e C) 20 dias após a 8ª inoculação  Conclusão Mesmo com título baixo, o soro foi eficaz para detectar Pm nos tecidos quando utilizado como marcador para IHQ.  Referências  1. HOLT, J G.; et. al. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9° ed.; Williams & Wilkins: USA, 1994. 2. QUINTELLA, L. P.; et al. Immunoperoxidase Technique using an anti-Leishmania (L.) chagasi  Hyperimmune serum in the diagnosis of culture-confirmed American tegumentary Leishmanasis. São Paulo: Instituto de medicina de São Paulo, 2009. SCIELO. 3. TURNI, C.; BLACKALL, P. J. Comparisons of the indirect haemaglutination and gel diffusion test for sorotyping Haemophilus parasuis. Veterinary Microbiology, 24, 839-840, 2000. 

Produção de soro hiperimune para detecção de Pasteurella multocida.

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