ARAUJO NETO, R. B. de

LIMA, P. S. da C.

MENDES, R. F. de M.

NASCIMENTO, M. P. S. B. C. do

SANTOS, M. F. dos

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Análise de similaridade entre acessos de catingueira (Caesalpinia spp.) com base nos marcadores RAPD.

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Proceedings of the III International Symposium on Forage Breedingth thNovember 7  to 11 , 2011 / Bonito, MS / BrazilISBN 978-85-297-0254-4III International Symposium on Forage Breeding Análise de similaridade entre acessos de Catingueira (Caesalpinia spp.) com base nos marcadores RAPDRaul Ferreira de Miranda Mendes1, Michelli Ferreira dos Santos2, Raimundo Bezerra de Araujo Neto3, Maria Perpetuo Socorro Bona Cortez do Nascimento3, Paulo Sarmanho da Costa Lima3, IntroduçãoA  vegetação  de  caatinga  é  constituída, especialmente,  de espécies  lenhosas  e herbáceas  de pequeno  porte.  As  espécies lenhosas  são fundamentais  no  contexto  de  produção  e disponibilidade  de  forragem  no  semi-árido nordestino.  Entre as espécies  nativas da caatinga,  a Catingueira-verdadeira  (Caesalpinia  pyramidalis Tul.)  apresenta  grande  potencial  forrageiro,  pois  é uma das plantas sertanejas  cujas gemas brotam nas primeiras  manifestações  de  umidade.  Dessa  forma, no início do período das chuvas o gado procura as folhas jovens extremamente palatáveis,  sendo, entre outras,  preferidas  por  bovinos,  caprinos  e  ovinos (HARDESTY et al., 1988). Segundo Kadama (2006), uma etapa fundamental, no  melhoramento  genético,  é  a  obtenção  de variabilidade  genética  entre  indivíduos  de  uma espécie  ou  entre  grupos  de  cruzamentos interespecíficos.  Portanto,  uma  das  etapas indispensáveis  é  o  conhecimento  da  diversidade genética, principalmente em espécies que ainda não foram  domesticadas,  como  a  Catingueira.  Os marcadores  moleculares  são  ferramentas  eficazes para  estudos  de  genética,  especialmente  para  o melhoramento  genético  das  espécies  de  interesse econômico.  Existem  diversos  tipos  de  marcadores moleculares  e  cada  marcador  apresenta características específicas.Entre  os  marcadores  moleculares  baseados  em PCR (Polymerase Chain Reaction), a técnica RAPD (Random  Amplified  Polymorfhic  DNA)  tem  sido amplamente  utilizada,  pois  apresenta  vantagens, quando  comparado  com  outros  marcadores. Apresenta  um  custo  inferior  e  é  mais  fácil  a execução. Também não é necessário o conhecimento prévio  dos  organismos  de  interesse,  como  por exemplo, desenvolvimento prévio de uma biblioteca de  sondas  específicas.  Outra  vantagem  é  que  um conjunto  único  de  primers arbitrários  pode  ser utilizado para qualquer organismo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade  genética  de  Catingueira  por  meio  de marcadores RAPD.Material e métodosForam coletadas  folhas  jovens de  10  acessos  de plantas  de  catingueira  oriundos  do  Banco  de Germoplasma  de  Forrageiras  da  Embrapa  Meio-Norte  localizado  em  Teresina-PI.  As  folhas  foram colocadas no isopor com gelo até serem armazenadas no freezer para posterior extração.A  extração  de  DNA  foi  realizada  com  material fresco  e  macerada  em  homogeinizador  Precellys. Utilizou-se  o  Kit  de  extração  da  Quiagen.  A quantificação do DNA extraído foi feito em gel  de agarose a 0,8% com TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x e corado  com  GelRed™ ,  foi  feita  a  quantificação comparando o DNA das amostras com o DNA λ na concentração de 100 ng. Para  a  análise  de  marcadores  RAPD  foram testados 100 primers dos quais 8 foram selecionados. As  reações  de  amplificação  foram  preparadas  em volume final de 20 µl contendo 15 ng de DNA, 0,25 mM de dNTP, 1U de TaqPolimerase (Invitrogen), 0,2 μM de primer, 3,0 mM de MgCl2, 2,0 µl l de tampão 1X e H2O ultrapura. As reações  de amplificação  foram realizadas  em termociclador Veriti seguindo um programa com uma etapa  inicial  de  desnaturação  de  1  min  a  92ºC, seguida  de  45  ciclos  de  1  min  a  92°C  para desnaturação, 1 min a 35°C para anelamento, 2 min a 72°C  e  uma  extensão  final  de  5  min  a  72°C.  Os produtos das reações foram visualizados em gel  de agarose  a  1,5%,  corado  com  GelRed™ e fotodocumentados sob luz ultravioleta.__________________________1. Biólogo, Universidade Estadual do Piauí, Teresina, PI. Email: raul-mendes@hotmail.com2. Mestranda em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI. Email: michelly_m_santos@yahoo.com.br3. Pesquisador Embrapa Meio Norte, Teresina, PI. Email: sarmanho@cpamn.embrapa.com.br; sbona@cpamn.embrapa.com.br ; rbezerra@cpamn.embrapa.br215Proceedings of the III International Symposium on Forage Breedingth thNovember 7  to 11 , 2011 / Bonito, MS / BrazilISBN 978-85-297-0254-4III International Symposium on Forage Breeding Foi  construída  uma  matriz  para  os  fragmentos polimórficos  amplificados  que  foram  codificados  em um sistema binário, atribuindo-se (1) para presença e (0) para ausência de banda. Somente foram consideradas as bandas  que  não  davam  margens  a  dúvidas.  Bandas muito fracas, de difícil resolução, não foram incluídas. Para  análise  dos  dados,  utilizou-se  o  programa  Past (método UPGMA).   A similaridade  entre  as amostras foi  estimada  pelo  coeficiente  de  Dice,  que  gerou  a matriz  de  similaridade.  Esta  análise  viabilizou  a construção  de  um  dendrograma  que  mostrou graficamente a similaridade entre as amostras. ResultadosForam selecionados oito  primers:  A08, A09, M01, M04, M15, M20, N06 e P06.A  matriz  de  similaridade  obtida demonstrou  haver variabilidade  entre  as  amostras,  com  coeficientes  de similaridade  variando  de  0,45  a   0,74   (Tabela  1). Apresentou  uma  média  de  similaridade  de  0,59.  A maior similaridades está entre os genótipos  8 e 9 e a menor entre os genótipos 2 e FG 2. O Dendrograma gerado permitiu a separação em três grupos  (dgm = 0,59)  (Figura  1).  Demonstra também a diversidade  genética  das  duas  espécies  analisadas,  a Caesalpinia pyramidalis Tul.(acessos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 10) e a Caesalpinia bracteosa Tul. (acessos Fg1 e Fg2), ficando separadas no dendrograma.DiscussãoA  aplicabilidade  de  marcadores  RAPD  em estabelecer  a  relação  genética  de  germoplasmas  de Catingueira  mostrou-se  satisfatório,  pois  se  observou grande  diversidade  genética  entre  os  genótipos analisados.  Os  resultados  obtidos  aqui  evidenciaram uma menor diversidade genética entre os genótipos 8 e 9  que  são  da  mesma  espécie.  A  maior  diversidade genética observada foi entre os genótipos 2 e  Fg2, que está  de acordo com o esperado,  pois  o genótipo 2 é classificado como Caesalpinia pyramidalis Tul. e o Fg2 pertence a espécie  Caesalpinia bracteosa Tul. A identificação  dos genótipos de Catingueira   com maior  e  menor  divergência  genética  possibilitará  a execução de melhoramento com a forrageira  que vise a obtenção  de  maior  segregação  e  a  recuperação  das características  do  parental  recorrente  (Franco  et  al, 2001).   A alta concentração de genótipos (4, 8, 9, 6, 3 e 2) reunidos  no  terceiro  grupo  permitiu  inferir  que  esses materiais genéticos apresentam a mesma procedência. ReferênciasHARDESTY, L. H.; BOX, T. W.; MALECHEK, J. C.  Season  of  cutting  affects  bio  mass  production  by coppicing  browse  species  of  the  Brazilian caatinga. Journal  of  Range  Management, v.41,  n.6, p.447-80, 1988.  KAMADA,  Takesi.  Avaliação  da  diversidade genética  de  populações  de  fáfia  (Pfaffia  glomerata (Spreng.) Pedersen) por RAPD, caracteres morfológicos e teor de beta-ecdisona. Viçosa:UFV,2006.HAYMER,  D.  S.,  McINNIS,  D.  O.  Resolution  of populations of the Mediterranean fruit fly at the DNA level  using random primers  for  the  polymerase  chain reaction. Genome, v. 37, p. 244-8, 1994.FRANCO,  Marília Caixeta;  CASSINI,  Sérvio Túlio Alves; OLIVEIRA, Valter Rodrigues; TSAI, Siu Mui. Caracterização  da  diversidade  genética  em feijão  por meio  de  marcadores  RAPD.  Brasília:Pesq.  agropec. bras. vol.36 no.2. 2001 216Proceedings of the III International Symposium on Forage Breedingth thNovember 7  to 11 , 2011 / Bonito, MS / BrazilISBN 978-85-297-0254-4III International Symposium on Forage Breeding Tabela 1. Matriz de similaridade genética entre 10 genótipos de Catingueira gerada pelo coeficiente de Dice de locus de RAPD. 2 3 4 5 6 8 9 10 FG1 FG223 0,688894 0,68085 0,666675 0,55102 0,61702 0,612246 0,50505 0,67368 0,64646 0,582528 0,59794 0,64516 0,72165 0,51485 0,686279 0,58252 0,66667 0,71845 0,65421 0,7037 0,7358510 0,54167 0,63043 0,52083 0,66 0,49505 0,54545 0,62857FG1 0,54945 0,5977 0,57143 0,48421 0,58333 0,53191 0,54 0,49462FG2 0,4466 0,58586 0,50485 0,50467 0,55556 0,50943 0,51786 0,47619 0,68   Figura 1. Agrupamento de 10 genótipos de Catingueira. 100946870494041354201,22,43,64,867,28,49,610,80,540,60,660,720,780,840,90,96SimilaridadeFG1FG2510489632217

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