CASTILLO, P.

CRUZ, I.

GLADSTONE, S.

RIZO, C.

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UNAN-OEA Control microbialCAPITULO XXXVILABORATORIO SOBRE PATOGENOSMICROBIALES: POSTULADOS DEKOCH. TECNICAS DE AISLAMIENTO,INOCULACION Y VERIFICACION DESINTOMAS EXTERNOSPatricia CastilloiCannen Rizo1Sally Gladstone1IvánCruiA. INTRODUCCIONPara verificar el agente etiológico de unaenfermedad en un insecto, es necesarioestablecer una relación causal entreelmicroorganismo y Ia enfermedad para querealmente se pueda demostrar su patogenicidad.Asimismo, los microorganismos o agentescausales deberán someterse a Ia prueba de lospostulados de Koch, los cuales manifiestan queel agente causal deberá ser aislado deihospedero susceptible, producido en medios decultivo puros e inoculados en hospederossusceptibles y presentar los mismos sintomas deihospedero dei cual fue ais lado.Los procesos de aislamiento son variados ydependen dei patógeno bajo estudio.Generalmente consisten en Ia esterilización de Iasuperfície dei insecto muerto con hipoclorito desodio ai 5% y lavadas continuas con aguadestilada y tiosulfato de sodio.Para el caso de hongos y bacterias los cuerposesterilizados son abiertos para 'transferir unaporción dei tejido afectado a medios de cultivosadecuados, los cuales son incubados atemperaturas entre 25-28°C.EI reaislamiento dei patógeno de los medi os decultivo puros es realizada por centrifugacióndiferencial.Para el caso de virus, protozoarios y algunoshongos parásitos abligatorios, que no pueden sercultvados en médios artificiales, el inóculo podráser obtenido de insectos enfermos, purificado através de centrifugaciones diferencialesUNAN, Le6n, Nicaragua.2 CNPMS/EMBRAPA, Brasil.7/12 UNAN-OEAControl microbial(1000-3500 rpm) y el sedimento (inóculo)resuspehdido en agua destilada.La inoculación debe realizarse en hospederossanos que generalmente deberán ser de Iamisma especie dei insecto dei cual fue aislado.Lossintomas externos generalmente aparecen aIa 72 horas después de inoculados, condisminución dei apetito, disminuci6n de Iamovilidad, disturbios en el hemocelo ydesbalance dei sistema digestivo. Para el casodei Vírus de Ia Poliedrosis Nuclear y bacterias, eltegumento se vuelve blando y rápidamente sedeterioran los tejidos y se rompe el tegumento.Para el caso de hongos, el tegumento se tomapolvoriento por el crecimiento de Ias esporas ytoma diferentes coloraciones dependiendó deipatógeno.B. OBJETIVOS1.Conocer Ia técnica de aislamento más usada virus y hongos.para virus.3.Diferenciar los sintomas de bacterias, virus y2.Familiarizarse con Ia técnica de inoculaci6n con hongos.C. METODOLOGIASe formarángrupos de cuatro personas.1. AISLAMIENTO DE VPNa. Tomar larvas de Spodoptera sunia muertas porvirus, agregar agua destilada y macerar.b. Filtrar Ia soluci6n con gasa para evitar restosde tegumento, cápsulas cefálicas y particulasgruesas.c. Juntar Ia solución de todos los grupos en tubosdjl c.,sayo y centrifugar a 1000 rpm por unminuto.d. Descartar el sedimento, centrifugar de nuevoel caldo, descartar el sedimento.e. Centrifugar nuevamente el caldo a 3000 rpmpor 10 minutos, descartar el caldo y elsedimento, que son los cuerpos de inclusiónpoliedral, suspenderlos en agua destilada.f. Verificación microscópica dei patágeno.2. INOCULACION DE VPN ENHOSPEDEROS SANOSa. Tomar 30 copas con dieta merídica y agregar80 microlitros de Ia solución viral.b. Colocar una larva en cada copita, tapar yrotular. La observación de los sintomas debeser tomada diaria hasta que muera el últimóejemplar.Para confirmar Ia identidad dei agente etiológicoeste debe ser ais lado de nuevo y comparado conel prime r aislamiento.

Laboratorio sobre patogenos microbiales: postulados de Koch, tecnicas de aislamiento, inoculacion y verificacion de sintomas externos.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488629/1/Laboratoriopatogenos.pdf

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