BRENTANO, L.

CARON, L.

ESTEVES, P. A.

IANISKI, F.

JAENISCH, F. R. F.

KLEIN, T. A. P.

SILVA, V. S.

TREVISOL, I. M.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Otimização da avaliação da atividade ciliar em traquéias como parâmetro para determinar a eficácia de vacinas vivas de bronquite infecciosa.

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Anais do Prêmio Lamas - 2011Sanidade OTIMIZAÇÃO DA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CILIAR EM TRAQUÉIAS COMO PARÂMETRO PARA DETERMINAR A EFICÁCIA DE VACINAS VIVAS DE BRONQUITE INFECCIOSA  IM Trevisol, FR Jaenish, VS Silva, L Brentano, TAP Klein, F Ianiski, L Caron, PA Esteves Embrapa Suínos e Aves – CNPSA. Concórdia, SC, Brasil.IntroduçãoNo Brasil, a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) tem sido controlada com vacinação desde 1979, quando a primeira vacina foi licenciada (4). Falhas de proteção tem sido relatadas nos últimos anos e a ocorrência de manifes-tações clínicas diversas são associadas as variações do vírus e aparecimento de amostras variantes (1). Especula--se que essas variantes resultam em proteção cruzada “pobre” frente a amostra vacinal disponível no nosso país. A identificação de variantes e a avaliação frente a vacina viva, auxiliará no entendimento desses casos clínicos e na adequação dos procedimentos de controle. Porém, determinar a eficácia de uma vacina viva, requer instala-ções específicas, pessoal qualificado, tempo e um método confiável e exequível. Há muito descrito na literatura, mas nossa experiência tem mostrado a dificuldade em manter padrões de leitura e interpretação para o principal índice de validação de uma vacina viva para BIG. Este índice é o percentual de proteção indicado pela atividade ciliar em anéis de traquéias colhidas de aves vacinadas e desafiadas. A partir desta dificuldade, trabalhamos para adequar este sistema, para uma avaliação exequível e menos subjetiva.Material e MétodosAs aves utilizadas para otimização desse método foram vacinadas e desafiadas conforme descrito anteriormente (5). Brevemente, aves SPF foram vacinadas com amostra H120 e desafiadas com amostra de referência e com amos-tras isoladas e casos clínicos. Cinco dias após o desafio, as traquéias foram colhidas imediatamente após o sacrifício de cada ave, com o mínimo de trauma possível e levadas ao laboratório. Cada traquéia foi dividida 3 porções: pro-ximal (p), mediana (m) e distal (d). Com lâmina de bisturi nº10, 3 secções transversais de aproximadamente 2mm foram feitas de cada porção, resultando em 9 anéis por ave. Microplacas de cultura celular com 96 orifícios foram previamente preenchidas com 250ul de meio de cultura F10-199 contendo 100UI de penicilina G sódica e 100ug de estreptomicina/mL. Os anéis foram delicadamente colocados na placa, conforme esquema abaixo:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12p Am Bd CDEFGH    A leitura ocorreu imediatamente após a colocação dos anéis na microplaca e até 4 horas após a colheita. Os cri-térios utilizados estão descritos na Tabela 1. As secções de traquéias dos grupos controles não inoculado e inoculado com a amostra patogênica de referência foram utilizadas como padrão para os graus zero e 3 respectivamente. Foram feitas imagens em tempo real destes e dos graus intermediários, para estudos posteriores.Tabela 1 - Escore Embrapa para avaliação de atividade ciliar em anéis de traquéias.Quantidade de cíliosVelocidade do movimentoGrautodos vigoroso zerotodos lento 1alguns muito lento 2nenhum sem movimento 3Resultados e DiscussãoA partir de informações da literatura (2, 3), o procedi-mento foi adaptado para microplacas de cultivo celular. Nos primeiros experimentos, os anéis de traquéia eram colocados em tubos de ensaio, dificultando a leitura pelo formato arredondado que movimenta-se facilmente sobre a mesa do microscópio, além de não ser um material adequado para leitura. Também havia dificuldade em comparar anéis da mesma ave (sobreposição de anéis) e comparar anéis de diferentes aves (difícil manter os tubos lado a lado), pois cada ave estava em um tubo. A utiliza-ção de microplacas facilitou a leitura, pela estabilidade na mesa e a visualização ficou fácil uma vez que o material é específico para leitura ao microscópio. A comparação entre anéis da mesma ave e entre aves foi resolvida pela disposição dos anéis. Na literatura, a interpretação em graus de ciliostase (parada nos batimentos ciliares) é: zero (todos os cílios batendo) até 4 (ausência de bati-mento), porém não há detalhes de como interpretar isso. O “escore Embrapa” esta sendo validado em um estudo que envolveu 8 tratamentos, 120 aves e um total de 1080 anéis de traquéias. Nesse estudo, além da leitura imediata dos anéis, porções proximal, mediana e distal de cada ave (3/ave) foram colhidas de forma individualizada em formol a 10% para avaliação histopatológica. Essa ava-liação também vai gerar graus de zero a 3, quanto maior o número, maior a severidade das lesões ou alterações. Ao final do processamento desse material, uma análise estatística irá comparar os dois métodos para validação.ConclusãoA padronização de um escore de leitura com critérios específicos e exemplos gravados em vídeo facilitou muito a interpretação do ensaio, aumentou a confiabilidade e a reprodutibilidade. Bibliografia1. Back A. 21º Congresso Brasileiro de Avicultura - Anais, 2009, Porto Alegre, RS; 211-215.2. Darbyshire JH. Avian Pathology 1980; 9:179-1843. OIE Terrestrial Manual 2008; chapter 2.3.2: 443-455.4. Silva EN. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2010, 12(3):197-203. 5.Trevisol et al. Rev. Bras. de Ciê. Av. 2006, suplemento 8, p240. { { {ave 1 ave 2 ave 3

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