BESSA, M. C.

BIESUS, L. L.

COLDEBELLA, L.

CURIOLETTI, F.

GUGEL, L. A.

KICH, J. D.

PALHARES, J. C. P.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Avaliação da presença de salmonella no rio Pinhal associada a solo e fezes de suínos e bovinos de leite em Concórdia, SC.

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AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE Salmonella NO RIO PINHAL ASSOCIADA A SOLO E FEZES DE SUÍNOS E BOVINOS DE LEITE EM CONCÓRDIA,SC. Bessa,M.C1.; Gugel,L.A2.; Biesus L.L3.; Kich,J.D.4; Palhares,J. 4 Curioletti, F 5. Coldebella L. 6 1Pos-doutoranda-PNPD-CAPES 2Bolsista PIBIC/CNPQ Embrapa Suínos e Aves.   3Assistente da Embrapa Suínos e Aves. 4Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves jalusa@cnpsa.embrapa.br palhares@cnpsa.embrapa.br 5Bolsista CNPq da Embrapa Suínos e Aves 6Zootecnista  RESUMO Os enteropatógenos, como a Salmonella, são excretados nas fezes de animais e homem podendo contaminar o solo e água. Para demonstrar esta contaminação, o presente estudo objetivou associar amostras de Salmonella isoladas do rio Pinhal com aquelas presentes no solo e fezes de suínos e bovinos de leite de propriedades rurais em Concórdia,SC. A partir da análise microbiológica das amostras verificou-se que 50% das propriedades estudadas (7/14) apresentaram Salmonella em suínos e em 29%(4/14) em bovinos de leite. Comprovou-se uma ocorrência maior em suínos, 25,6% do que em bovinos, 15 %. Apenas uma propriedade apresentou o patógeno no solo de lavoura. Todos os pontos de coleta no rio apresentaram Salmonella em pelo menos uma das amostragens. Duas propriedades foram destacadas pelo fato de apresentarem elevado índice de isolamento de Salmonella nos animais e por estarem próximas aos pontos de maior incidência do rio. A aplicação de métodos fenotípicos e genotípicos nas amostras de Salmonella será uma importante ferramenta para identificar a fonte de contaminação do rio Pinhal. PALAVRAS-CHAVE: Rio Pinhal, bactéria, impacto ambiental ABSTRACT This study aimed to associate the Salmonella present in the Pinhal River with soil and faeces of pigs and dairy cattle from farms in Concordia,SC. From the microbiological analysis of samples found that 50% of farms studies (7/14) had Salmonella in pigs and in 29% (4/14) in dairy cattle. Showing a higher occurrence in swine, 25,6% from cattle, 15%. Only one farm showed the pathogen in soil. All collection sites in the river had Salmonella. Two properties were highlighted by presenting high levels of Salmonella in animals and being near the points of highest incidence of river. Application of phenotypic and genotypic methods in Salmonella is an important tool to identify the source of contamination of the Pinhal River. KEYWORDS: Pinhal River, bacteria, environmental impact.  INTRODUÇÃO A suinocultura intensiva em regiões produtoras de suínos apresenta grandes problemas ambientais devido à elevada produção de resíduos e ao fato de serem utilizados como biofertilizante na lavoura. A maior parte dos dejetos não é manejada adequadamente e ao utilizarem como biofertilizante poderá levar a contaminação dos recursos hídricos e colocar em risco a sustentabilidade da atividade produtiva (Bohrer, 2003; Assis, 2004). Sigua et al. (2009) detectaram a presença de E. coli e Salmonella em água do Rio Pinhal, no oeste de Santa Catarina, região de intensa produção suinícola e Berno (2009) verificou neste mesmo rio a presença de sorovares de Salmonella resistentes a antimicrobianos utilizados no sistema de produção animal. Este fato é preocupante uma vez que a inclusão de antimicrobianos na ração como promotores de crescimento e/ou seu uso terapêutico, metafilático ou profilático é amplamente utilizada em nosso meio, podendo contribuir para o aparecimento de cepas resistentes e patogênicas (Carvalho et al. 2006).  As bactérias são importantes não somente como patógenos para animais e humanos, mas também como carreadores e transmissores de genes de resistência. O uso de antibióticos na agricultura animal é considerada um risco potencial para a saúde humana devido a resistência bacteriana (Bicudo e Goyal,2003). Métodos de tipificação molecular que apresentam um maior poder discriminatório têm sido usados em associação aos métodos fenotípicos. Essas ferramentas apresentam poder de discriminação suficiente para elucidar a origem e a distribuição de Salmonella sp. (Bessa et al., 2007; Gebreyes et al., 2006; Vieira-Pinto et al., 2006). O presente estudo objetiva associar a presença de Salmonella no rio Pinhal com a encontrada no solo e fezes de suínos e bovinos de leite em propriedades rurais que compões a bacia deste rio. MATERIAL E MÉTODOS Amostragem No período de janeiro a maio de 2010 foram amostradas 10 pontos da microbacia do rio Pinhal, Concórdia-SC, e 14 propriedades rurais localizadas próximas ao rio. Esta região é caracterizada pela grande concentração de suinocultura e bovinocultura de leite. Foram coletadas, individualmente, fezes do reto de 10% dos animais (suínos e/ou bovinos) presentes em cada instalação. As amostras foram constituídas de pools de 6 animais. As coletas de solo foram realizadas em 10 a 15 pontos diferentes, com profundidade entre 0 a 20 cm, em forma de zig-zag em 13 propriedades que possuíam histórico de adubação orgânica por dejetos de animais. Para a coleta de material da água do rio foram elaboradas buchas de algodão esterilizadas coberta por gaze conforme descrito por Quinn et al.(1994) e amarradas ao longo de um cordão de 2,80m,permanecendo por 48h no rio. Caracterização fenotípica de Salmonella sp. Todas as amostras foram submetidas ao método de isolamento de Salmonella descrito na ISO 6579 adaptado por Michael et al. (2003). Posteriormente, as amostras serão enviadas à Fundação Instituto Oswaldo Cruz, no Rio de Janeiro, para sorotipificação. Para a determinação da suscetibilidade a antimicrobianos será utilizado o teste de difusão em ágar, o qual será conduzido de acordo com as normas dos documentos M100-S15 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2005). Serão testados os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico, ampicilina, canamicina, cefalotina, Ceftiofur, ceftazidima, cefotaxima, ceftazidima-ácido clavulânico, cefotaxima-ácido clavulânico; ciprofloxacina, cloranfenicol, espectinomicina estreptomicina, florfenicol, gentamicina, penicilina, tetraciclina, sulfametoxazol; trimetoprima e trimetoprim-sulfametoxazol.  Caracterização genotípica de Salmonella sp. A extração plasmidial será realizada pelo protocolo proposto por Kado e Liu (1981). O DNA plasmidial será extraído pelo processo de lise alcalina. O plasmídeo de virulência da S. Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001) será utilizado como marcadores de peso molecular. A macrorrestrição do DNA total será preparado de acordo protocolo do PulseNet (CDC). A análise dos fragmentos ocorrerá pela separação dos mesmos em eletroforese de campo pulsado em gel de agarose 1%, num sistema CHEF DR III (BioRad, USA), a 6V/cm e com tampão de corrida 0,5x TBE. Os pulsos programados serão de 2,2 – 63,8s por 18h. Os perfis eletroforéticos gerados por PFGE serão analisados utilizando-se o software BioNumerics (Applied Maths, Belgium).  RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados, parcialmente alcançados, referem-se à presença de Salmonella nas fezes dos animais e solo amostrados em cada granja e a localização dessas propriedades em relação aos pontos de coleta no rio (Tabela 1). Em 50% das propriedades estudadas (7/14) foi isolada Salmonella em suínos e em 29% (4/14) em bovinos de leite. Apenas uma propriedade apresentou o patógeno em amostras de solo. A maior incidência de amostras positivas foi observada em suínos, 25%. Nos bovinos o isolamento de Salmonella ocorreu em 15 % das amostras.  Estudos realizados no sul do Brasil relataram uma ampla distribuição de Salmonella ao longo da cadeia de produção de suínos. Bessa et al. (2004) encontraram 55,66% de suínos portadores de Salmonella abatidos em frigoríficos do Rio Grande do Sul. Posteriormente Schwarz et al (2009) relataram a prevalência de 71,6% da mesma região com soroprevalência de 77,8%. KICH et al (2005) avaliaram 65 granjas em Santa Catarina, dessas, 98% (64/65) apresentaram animais positivos no teste de ELISA, sendo que a soroprevalência total foi de 57,6%.  A Tabela 2 mostra o número de isolados de Salmonella em cada ponto de coleta nas águas do rio Pinhal. A maior ocorrência de Salmonella foi observada nos pontos 2, 4, 5 e 6, com cinco isolados em cada ponto. Sendo que no ponto 5 se concentra a produção animal e a área agrícola. Estudos anteriores, no estado de Santa Catarina demonstraram a gravidade do problema causado pelos altos índices de contaminação de águas superficiais decorrentes da suinocultura (Seganfredo e Girotto, 2002). As propriedades 11 e 12, as quais apresentaram elevado índice de isolamento de Salmonella, estão localizadas próximas aos pontos 6 e 5 do rio, respectivamente. Sugerindo, com estes resultados preliminares, que a Salmonella presente nos suínos em regiões produtoras pode atingir os recursos hídricos da região. O segundo passo deste trabalho será a aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica nas amostras de Salmonella para obter um melhor entendimento da epidemiologia do patógeno.  CONCLUSÕES Os suínos e bovinos produzidos na microbacia do rio Pinhal excretam Salmonella nas fezes podendo contaminar o solo e o rio.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Assis, F. O.  Bacia hidrográfica do rio Quilombo: dejetos de suínos e impactos ambientais . UFPR, Curitiba, 2004. BERNO, L. G. ; KICH, J. D. ; Palhares, J. C. P. ; Biesus, L. L. . Determinação do perfil de sensibilidade e resistência antimicrobiana em amostras de salmonella sp. isoladas do rio pinhal, Concórdia/SC. In: 3ª jornada de Iniciação Científica Embrapa/UnC - JINC, 2009, Concórdia. Bohrer, P.H.A suinocultura brasileira. Congresso brasileiro de veterinários especialistas em suínos,  2003, Goiânia. Anais... Goiânia: ABRAVES,2003. p.46-64. Bessa, M.C., Costa, M.; Cardoso,M. (2004). Prevalência de Salmonella sp. em suínos abatidos em frígoríficos do Rio Grande do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, 24:80-84. Bessa, M.C.; et al. Phenotypic and Genetic Characterization of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Isolated From Pigs in Rio Grande do Sul, Brazil. Researche Veterinary Science (in press 10.1016/jrvsc.2007.01.006), 2007.  Bicudo,J.R.; Goyal,S.M. (2003).Pathogens and manure management systems:a review. Environmental Technology,24,115-130. Carvalho, F. C. T.et al. Resistência a antimicrobianos de cepas de Salmonella isoladas de água, sedimento e camarão de quatro fazendas de carcinicultura do Estado do Ceará. In: Simpósio de Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos, 3., 2006, Rio de Janeiro. Resumos... p. 43. CSLI/NCCLS, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial testing; 15 Suplemento Informativo. CLSI/NCCLS documento M100-S15. Wayne, 2005. Gebreyes, W.A.; et al. Molecular Epidemiology and Diversity of Salmonella serovar Typhimurium in Pigs Using Phenotypic and Genotypic Approaches. Epidemiology and Infection , 134:187-198, 2006. Kado, C.I.; Liu, S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. Journal of Bacteriology, 145: 1365-1373, 1981. Kich. J. Nelson Mores2 Itamar Antonio Piffer3 Arlei Coldebella. Armando Amaral5 Lucas Ramminger6 Marisa Cardoso. Fatores associados à soroprevalência de Salmonella em rebanhos comerciais de suínos 2005.Ciência Rural, Santa Maria, v.35, n.2, p.398-405, mar-abr, 2005 Mcclelland, M., et al. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature, 213: 852-856, 2001. Michael,G.B.;Simoneti,R.;Costa,M.;Cardoso,M.(2003).Comparison of different selective enrichment steps to isolate Salmonella sp. From feces of finishing swine. Braz. J. Microbiol., 34, 138-142. Quinn, P.J. et al. Clinical Veterinary Microbiology. London, 1994, 648p. Schwarz, P. et al. (2009).Salmonella entérica isolamento e soroprevalência em suínos abatidos no Rio Grande do Sul. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61(5), p.1028-1034. Seganfredo, M.A.; Girotto, A.F. Viabilidade econômica dos dejetos, em unidades terminadoras de suínos.Comunicado Técnico 301, Embrapa/CNPSA,2002. Sigua,G.C; Palhares,C.P.;Kich,J.D.;Mulinari,M.R.; Mattei,R.M.; Klein,J.B. Microbiological quality assessment of watershed associated with animal-based agriculture in Santa Catarina, Brazil. Water Air Soil Pollut,Published online: 04 November 2009. Vieira-Pinto, M.; et al. Unveiling Contamination Sources and Dissemination Routes of Salmonella sp. in Pigs at a Portuguese Slaughterhouse Through Macrorestriction Profiling by Pulsed-Field Electrophoresis. International Journal of Food Microbiology, 110:77-84, 2006. Tabela 1. Presença de Salmonella nos animais analisados em cada granja e a sua localização em relação aos pontos do rio Granja Suínos (n/pool) % Bovinos (n/pool) % Solo % Ponto no rio 1 3/6 50     0/5     0     1/2      50     8 2 1/5 20      NC -     NC - 5 3 0/1 0 1/5 20 0/3 0 8 4 1/5 20 1/5 20 0/3 0 7 5 1/5 20 4/5 80 0/2 0 3 6  1/5 20 0/5 0 0/2 0 3 7 0/6 0     0/5     0     0/2     0     3 8 0/5 0 0/5 0 0/2 0 3 9 0/7 0 0/4 0 0/2 0 7 10 0/5 0 0/5 0 0/2 0 6 11 12/18 66,7 0/1 0 0/2 0 6 12 5/6 83,3 2/3 66,7 0/1 0 5 13 0/10 0      NC - 0/2 0 5 14 0/11 0 0/5 0 0/2 0 5 Total 24/95 25,6 8/53 15      1/27 3,7   Tabela 2. Número de isolados de Salmonella, distribuídos de acordo com os diferentes pontos de coleta, nas amostras de água do rio Pinhal no período de janeiro a maio de 2010. Data da amostragem P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Total isolados 06/1/2010 ₊ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ 7 13/1/2010 ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋ ₋ 3 03/2/2010 ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ 4 10/2/2010 ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ 3 03/3/2010 ₊ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ 3 09/3/2010 ₋ ₊ ₋ ₊ ₋ ₋ ₊ ₋ ₊ ₋ 4 07/4/2010 ₋ ₊ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ 3 14/4/2010 ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ 1 05/5/2010 ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ 2 26/5/2010 ₋ ₋ ₋ ₊ ₋ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ 2 Total 2 5 2 5 5 5 3 2 2 1 32  

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