O Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) gerou um banco de dados contendo mais de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Em trabalho preliminar, o banco foi minerado por meio de análise in silico e identificaram-se várias seqüências potencialmente associadas à resistência do cafeeiro a patógenos. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores (primers) que amplificaram as seqüências mineradas. Noventa pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos foram desenhados utilizando o programa computacional Primer3. A estabilidade dos oligonucleotídeos foi verificada por meio do programa PrimerSelect®. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Para a amplificação no termociclador, foram avaliadas diferentes combinações de tempo e temperatura, incluindo touchdown PCR. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, 40 iniciadores foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. Destes, 29 resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Os demais 50 estão sendo testados por PCR. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os dois grupos de indivíduos resistentes e susceptíveis. Para confirmar a possível ligação e seu potencial, o marcador está sendo testado em diferentes populações do Programa de Melhoramento da UFV/EPAMIG

ALVARENGA, S. M.

ANDRADE, F. T.

CAIXETA, E. T.

MACIEL, B. H.

SAKIYAMA, N. S.

ZAMBOLIM, E. M.

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Obtenção de marcador molecular potencialmente envolvido com a resistência do cafeeiro à ferrugem.

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OBTENÇÃO DE MARCADOR MOLECULAR POTENCIALMENTE ENVOLVIDO COM A RESISTÊNCIA DO CAFEEIRO À FERRUGEM   Bárbara HUFNAGEL Maciel1, E-mail: biocafe@ufv.br; Eveline Teixeira CAIXETA1,2; Flávia THIEBAUT Andrade1; Samuel Mazzinghy ALVARENGA1; Eunize Maciel ZAMBOLIM1,3; Ney Sussumu SAKIYAMA1,4  1 Universidade Federal de Viçosa (UFV)/ BIOAGRO, Laborátorio de Biotecnologia do Cafeeiro (Biocafé), 36570-000, Viçosa-MG. 2Embrapa Café,  3 UFV/ Departamento de Fitopatologia, 4 UFV/ Departamento de Fitotecnia. Apoio financeiro: Apoio financeiro: PNP&D/CAFÉ  Resumo:  O Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) gerou um banco de dados contendo mais de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Em trabalho preliminar, o banco foi minerado por meio de análise in silico e identificaram-se várias seqüências potencialmente associadas à resistência do cafeeiro a patógenos. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores (primers) que amplificaram as seqüências mineradas. Noventa pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos foram desenhados utilizando o programa computacional Primer3. A estabilidade dos oligonucleotídeos foi verificada por meio do programa PrimerSelect®. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Para a amplificação no termociclador, foram avaliadas diferentes combinações de tempo e temperatura, incluindo touchdown PCR. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, 40 iniciadores foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. Destes, 29 resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Os demais 50 estão sendo testados por PCR. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os dois grupos de indivíduos resistentes e susceptíveis. Para confirmar a possível ligação e seu potencial, o marcador está sendo testado em diferentes populações do Programa de Melhoramento da UFV/EPAMIG.  Palavras-chave: Hemileia vastatrix, Coffea, ESTs, genoma café.   OBTAINING MOLECULAR MARKER POTENTIALLY INVOLVED WITH COFFEE TREE RESISTANCE TO LEAF RUST  Abstract: The Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) generated a database containing more than 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). In a former work, the bank was mined by in silico analyses and several sequences potentially associated with the coffee tree resistance to pathogens were identified. Aiming to verify the involvement of these sequences with the coffee tree resistance to leaf rust, primers were designed to amplify the mined sequences. Ninety specific primers were synthesized using the computational program Primer3. The primers stability was tested by the program PrimerSelect®. Different PCR conditions were tested: concentrations of components reaction, combinations of time and temperature, including touchdown PCR. Using optimized reaction and amplification conditions, 40 primers were tested in 12 resistant and 12 susceptible genotypes to H. vastatrix. Twenty nine of those resulted in unique and sharp bands, and only one of these was polymorphic. The remaining 50 synthesized primers are being tested. The 40 specific primers permitted to find one molecular marker polymorphic between the resistant and susceptible genotypes. To confirm the possible linkage and its potential, the marker is being tested in different populations of the UFV/EPAMIG Breeding Program.  Key words: Hemileia vastatrix, Coffea, ESTs, coffee genome.   Introdução  A principal doença do cafeeiro é a ferrugem alaranjada, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk & Br. Esta doença ocorre em todas as regiões produtoras de café em todo o mundo. Assim, o estudo e a caracterização de fatores de resistência a este fungo são importantes para a ampliação dos conhecimentos sobre a interação planta-patógeno, podendo ser útil para o desenvolvimento de estratégias eficientes de controle para essa doença, incluindo o melhoramento genético visando o desenvolvimento de variedades resistentes. A biotecnologia do cafeeiro tem sido potencializada com o Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Neste projeto, realizou-se o sequenciamento do genoma funcional das três principais espécies de café, Coffea arabica, C. canephora e C. racemosa, e um banco de dados de mais de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags) foi disponibilizado (Vieira et al., 2006). As informações geradas pelo PBGC foram utilizadas para identificar genes envolvidos ou ligados à resistência do cafeeiro à ferrugem. Esse banco de dados foi minerado por meio de análise in silico, utilizando-se ferramentas de bioinformática. Foram identificadas várias seqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro à ferrugem. Com o objetivo de verificar se os genes ou ESTs identificados estão envolvidos ou ligados à resistência do cafeeiro à ferrugem, oligonucleotídeos iniciadores que os amplificam foram desenhados e testados em genótipos de café.   Material e Métodos   No processo de mineração do banco de dados do PBGC, realizado em um trabalho anterior, foram identificadas 8.968 seqüências que poderiam estar relacionadas com a resistência do cafeeiro à ferrugem. Para uma seleção dessas seqüências mineradas, estabeleceu-se um padrão de prioridade, classificando as ESTs em relação a maior ou menor possibilidade de estarem envolvidas com o processo de resistência do cafeeiro a patógenos. As seqüências foram numeradas de 1 a 4, sendo 1 as ESTs de maior prioridade e 4 as de menor. A priorização foi determinada a partir da análise da anotação automática de cada EST, considerando-se vários fatores, como organismo homólogo, função potencial da seqüência, E-value, score, porcentagem de reads na biblioteca RM1 e domínios conservados de proteínas. A partir dessa priorização, as seqüências foram selecionadas e iniciadores específicos que as amplificam foram desenhados.  O desenho dos iniciadores foi realizado no programa computacional Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Nesse programa foram estabelecidas algumas condições (Tabela 1) de forma a favorecer a funcionalidade dos oligonucleotídeos iniciadores desenhados. O item “Produto de PCR” permite estabelecer o tamanho desejado para o produto da reação. O item “Tamanho de iniciador” permite estabelecer o intervalo desejado para o tamanho do oligonucleotídeo a ser desenhado. Já a “Tm” se refere à temperatura média de fusão do iniciador gerado, estando relacionada à especificidade do mesmo no momento da amplificação. A “Porcentagem de CG” está relacionada com a concentração das bases Citosina e Guanina na seqüência dos iniciadores gerados, interferindo na temperatura de anelamento destes no momento da reação. A estabilidade dos oligonucleotídeos iniciadores desenhados, nas condições de reação, foi verificada pelo programa computacional PrimerSelect®. A estabilidade dos primers foi verificada pelo programa computacional PrimerSelect®.     Tabela 1 – Condições para o desenho de iniciadores obtidos pelo programa computacional Primer3.  CONDIÇÕES PARA O DESENHO DE INICIADORES Produto de PCR 400-600 pb e 200-600 pb Tamanho do Iniciador 18 a 24 pb Tm 55 a 60º C Porcentagem de CG 45 a 55     Para testar os oligonucleotídeos iniciadores específicos foram selecionados 24 genótipos do banco de germoplasma da UFV/EPAMIG, sendo 12 susceptíveis e 12 resistentes à ferrugem (Tabela 2). Os genótipos resistentes são importantes fontes utilizadas no Programa de Melhoramento.    Tabela 2 – Genótipos utilizados para o teste dos oligonucleotídeos iniciadores obtidos das ESTs potencialmente envolvidas com a resistência do cafeeiro a patógenos.  Indivíduos susceptíveis à ferrugem Indivíduos resistentes à ferrugem Código Genótipo Descrição Código Genótipo Descrição 1 UFV 570 Bourbon Amarelo da China 13 HT 440-22 Híbrido de Timor UFV 2 UFV 2945 Típica C-117 14 HT 443-3 Híbrido de Timor UFV 3 UFV 557-06 Coffea racemosa (triplóide) 15 HT 445-46 Híbrido de Timor UFV 4 UFV 2145-79 Catuaí Vermelho 16 HT 832-1 Híbrido de Timor UFV 5 UFV 2154-345 Catuaí Amarelo 17 HT 832-2 Híbrido de Timor UFV 6 Catuaí 2143-193 Catuaí Amarelo 18 HT 438-52 Híbrido de Timor UFV  7 Catuaí 2143-235 Catuaí Amarelo 19 HT 446-08 Híbrido de Timor UFV 8 Catuaí 2148-57 Catuaí Amarelo 20 CIFC 33-1 CIFC 33-1 9 Mundo Novo 2164-193 Mundo Novo UFV 21 CIFC 1343-269 CIFC 1343-269 10 Mundo Novo 2190-100 Mundo Novo UFV 22 CIFC 4106 CIFC 4106 11 Caturra 812 Caturra Amarelo 23 CIFC 420-10 CIFC 420-10 12 Coffea dewevrei excelsia Coffea dewevrei excelsia 24 CIFC 147-1 CIFC 147-1     Folhas jovens dos genótipos selecionados foram coletadas, congeladas e liofilizadas. O material genético desses genótipos foi extraído de acordo com o protocolo de Diniz et al. (2005).  Inicialmente, as condições ótimas para a reação de PCR e amplificação do DNA pelos oligonucleotídeos iniciadores obtidos foram estabelecidas. Para isso, diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas, incluindo concentrações e marcas comerciais de Taq DNA polimerase, MgCl2, dNTPs e oligonucleotídeos iniciadores. E para a amplificação no termociclador, foram avaliadas diferentes combinações de tempo e temperatura, incluindo touchdown PCR.   Definidas as condições de PCR, os pares de primers foram submetidos a testes com os genótipos selecionados (Tabela 1). A reação de PCR foi realizada em 20,0µL de solução contendo 30ηg de DNA, 0,8 unidades de Taq DNA polimerase, tampão 1x, 1mM de MgCl2, 60 µM de cada dNTP e 0,7 µM de cada oligonucleotídeos iniciadores. A amplificação foi efetuada em termociclador utilizando-se o procedimento touchdown PCR. Este procedimento consistiu em ema etapa de desnaturação inicial de 94 ºC, por 3 minutos, seguido de cinco ciclos com uma etapa de desnaturação a 94 ºC por 30 segundos, uma etapa de anelamento por 20 segundos e extensão a 72 ºC por 40 segundos. A temperatura de anelamento foi de 65 ºC a 60 ºC, reduzindo 1 ºC a cada ciclo. Após os 5 ciclos, procederam-se mais 30 ciclos com desnaturação a 94 ºC por 60 segundos, anelamento de 60 ºC por 20 segundos e extensão de 72 ºC por 40segundos.  Os produtos resultantes foram separados em gel de agarose 1,2%, corados com Brometo de Etídio e visualização com UV.   Resultados e Discussão   Das 8.968 ESTs potencialmente envolvidas com a resistência do cafeeiro, mineradas do banco de dado do PBGC, selecionou-se 831. A priorização destas 831 seqüências resultou em 41 seqüências de prioridade 1, 11 seqüências de prioridade 2, 55 de prioridade 3 e 724 de prioridade 4 (Figura 1). As seqüências classificadas como prioridades 1, 2 e 3 foram selecionadas para o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específico.    Prioridade 37%Prioridade 21%Prioridade 1 5%Prioridade 487%Valores de Priorização das Seqüências Figura 1 – Valores totais de priorização das seqüências mineradas.      Das 107 seqüências que haviam sido selecionadas, foi possível obter pares de iniciadores, que eram estáveis, dentro das condições estabelecidas, para 90 destas seqüências. Estes pares de iniciadores foram sintetizados.  Quarenta dos noventa oligonucleotídeos gerados foram testados. Desses, 29 amplificaram as seqüências mineradas, apresentando bandas únicas e bem definidas. Somente um iniciador (CARF 005) apresentou polimorfismo entre os indivíduos susceptíveis e os resistentes à ferrugem do cafeeiro (Figura 2).  Este iniciador polimórfico será testado em populações segregantes contendo diferentes genes de resistência, visando verificar a ligação do marcador desenvolvido a partir da EST com os genes de resistência à ferrugem do cafeeiro. O indivíduo 12, Coffea dewevrei excelsa, suscetível a todas as raças de Hemileia vastatrix existentes no Brasil, teve um fragmento amplificado pelo primer CARF 005, diferentemente dos demais indivíduos susceptíveis testados. Para elucidar esse resultado, o fragmento amplificado será seqüenciado e comparado com a seqüência de indivíduos resistentes.  Em relação aos outros 28 oligonucleotídeos iniciadores que não apresentaram polimorfismo, como CARF 028 (Figura 3), é possível que os fragmentos possuam pequenas diferenças dentro da seqüência e, por isso, não puderam ser observadas por eletroforese em gel. A existência desta diferença será verificada com análises de enzima de restrição e seqüenciamento para detecção de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Existe também a possibilidade da diferença estar no padrão de expressão dos genes de indivíduos resistentes e susceptíveis. Para a verificação da expressão diferencial, serão efetuadas análises de RT-PCR e ensaios de macroarranjo.     Figura 2 – Iniciador CARF 005 – Iniciador polimórfico entre indivíduos susceptíveis e resistentes à ferrugem. M= Marcador de peso molecular de 100 pb.  1-12 = Indivíduos susceptíveis. 13-24 = Indivíduos resistentes. (ver Tabela 2).      Figura 3 – Iniciador CARF 028. Exemplo de oligonucleotídeo iniciador monomórfico entre indivíduos susceptíveis e resistentes à ferrugem. M= Marcador de peso molecular de 100 pb.  1-12 = Indivíduos susceptíveis. 13-24 = Indivíduos resistentes (ver Tabela 2).    Conclusão  Este trabalho permitiu obter um marcador, desenvolvido a partir das ESTs do Projeto Brasileiro do Genoma Café, potencialmente associado à resistência do cafeeiro à ferrugem. O marcador foi capaz de diferenciar cafeeiros resistentes de suscetíveis. Após a confirmação da ligação com genes específicos de resistência à ferrugem, este marcador poderá ser utilizado para seleção assistida nos programas de melhoramento.     Referências Bibliográficas  Carvalho, V.L.; Chalfoun, S.M. (2000) Doenças do cafeeiro: Diagnose e controle. Belo Horizonte: EPAMIG. 44p. (Boletim Técnico, 58).  Diniz, L.E.C.; Sakiyama, N.S.; Lashermes, P.; Caixeta, E.T; Oliveira, A.C.B.; Zambolim, E.M.; Loureiro, M.E.; Pereira, A.A.; Zambolim, L. (2005) Analysis of AFLP marker associated to the Mex-1 resistance locus in Icatu progenies. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 5:387-393.  Vieira, L. G. E.; Andrade, A. C.; Colombo, C. A.; Moraes, A. H. de A.; Metha, A., et. al. (2006) Brazilian coffee genoma project: na EST-based genomic resource. Braz. J. Plant Physiol., 18(1):95-108. 

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