PEREIRA, L. F. P.

SANTOS, T. B.

TAKAHASHI, E. K.

VIEIRA, L. G. E.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Identificação e caracterização do gene galactinol sintase em Coffea arabica L.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO GENE GALACTINOL SINTASE EM Coffea arabica L. Tiago B. SANTOS 1 , Elizabete K. TAKAHASHI 1 , Luiz Filipe P. PEREIRA 2 e Luiz Gonzaga E. VIEIRA 1 E­mail: lvieira@iapar.br 1 Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), Londrina, PR, 2 Embrapa – Café, Londrina, PR. Resumo Com a finalização do Projeto Genoma Café (http:/ www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/), um conjunto de 150.000 seqüências expressas (ESTs) em diversos tecidos, em diferentes etapas de desenvolvimento e também em diversas condições ambientais, estão  disponíveis  para  estudos  in  silico  e  in vitro, no qual  se espera obter  informações quanto ao mecanismo de  resposta a estresses abióticos. Visando a caracterização dos genes relacionados ao estresse hídrico do café, através do banco de dados do Genoma  Café,  o  objetivo  deste  trabalho  foi  identificar  os  genes  de  galactinol  sintase.  A  partir  de  91  seqüências  foram encontrados 3 contigs (CaGolS1, 2 e 3), dos quais foram desenhados oligonucleotídeos. A expressão dos genes foi analisada através de RT­PCR em diferentes tecidos do cafeeiro (folha, raiz, ramo e botão floral), sob condições de campo. Nas análises somente foram detectados transcritos para o gene CaGolS3. A expressão dos genes CaGolS1 e CaGolS2 não foi observada em tecidos foliar sob condições normais, no entanto, dados de literatura e análise in silico das bibliotecas de cDNA indicam que esses genes são provavelmente expressos em tecidos sob estresse hídrico. Palavra­chave: Café, estresse abiótico, galactinol sintase IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF THE GALACTINOL SYNTHASE GENE IN Coffea arabica L. Abstract The Coffee Genome Project  (www.lge.ibi.unicamp.br/cafe) finished the sequencing of 150.000 expressed sequences tags (ESTs) from several tissues, different stages of development and several environmental conditions. These sequences are available  for  in  silico  and  in vitro studies, in which we expect to obtain information about the mechanisms of abiotic stress response. The objective of this study was to characterize genes of galactinol synthase, related to the water deficit, through the searching of Coffe Genome Database. Starting from 91 sequences we have found 3 contigs (CaGolS1, 2 and 3), which were used  to  design  oligonucleotides.  Gene  expression  was  analyzed  through RT­PCR  in  different  tissues  of  coffee  growing  at normal field conditions. The CaGolS2 showed transcription activity in leaves, while it was not possible to detect any transcripts from CaGolS1 and CaGolS3. According to the literature as well as the in silico analysis of the Coffee Genome, CaGolS1 and CaGolS3 may be expressed in plant tissues water deficit conditions. Key words: Coffea, drought stress, galactinol synthase Introdução Galactinol sintase (GolS), é a enzima que catalisa o primeiro passo na biossíntese dos oligossacarídeos da família da rafinose  (RFO)  (Keller e Pharr, 1996). Esta enzima está envolvida na regulação da partição do carbono, como também está diretamente implicada em muitos processos do desenvolvimento fisiológico nas plantas e na resposta a estresses abióticos. A GolS catalisa a formação de galactinol e UDP (uridine­5­diphosphate) a partir de UDP­gal e mioinositol. Têm sido realizado muitos estudos sobre a expressão do gene galactinol sintase sob condições de estresse. Em Cucumis melo foi verificado que galactinol  sintase  ativa  o  metabolismo  de  RFO  nas  plantas  sob  condição  de  estresse  hídrico,  sendo  que  a  ocorrência  da expressão desse gene se dá em folhas e sementes (Volk et al., 2003). Estudos de expressão utilizando gene gusA sob controle do promotor de Galactinol sintase de Cucumis melo, mostraram que a expressão gênica é especifica para as menores nervuras condutoras de floema em folhas de Arabidospis thaliana e tabaco. Este padrão de expressão é esperado, pois o principal papel de galactinol sintase é catalisar o primeiro passo da síntese de rafinose e estaquiose, açúcares que as curcubitáceas transportam no  seu  floema  (Turgeon,  1996).  Também  em  Cucumis  melo  foi  demonstrado  que  o  gene CmGolS1  é  expresso  em  folhasmaduras e nas sementes durante o seu desenvolvimento, enquanto que a expressão do gene CmGolS2 foi somente observada em folhas maduras. No  genoma  de  Arabidopsis  thaliana,  foram  encontrados  sete  genes  GolS.  Destes,  três  (AtGolS1,  2  e  3)  foram caracterizados  como  envolvidos  na  resposta  ao  estresse.  Os  genes  AtGolS1  e  2  foram  induzidos  sob  condições  de  estresse hídrico e salino, enquanto que o AtGolS3 foi induzido sob condições de baixas temperaturas. Os resultados obtidos mostraram que  GolS  é  a  enzima  principal  na  acumulação  de  galactinol  e  rafinose  sob  condições  de  estresse  abiótico,  os  quais possivelmente atuam como osmoprotetores em plantas tolerantes ao estresse hídrico (Taji et al., 2002). Em Ajuga reptans, planta que tem servido como modelo para estudar a regulação e a importância do metabolismo de rafinose, foram identificados e isolados dois cDNAs que codificam para genes de GolS distintos, designados GolS1 e GolS2, respectivamente (Sprenger et al., 2000). O presente trabalho teve como objetivo a exploração do banco de dados do Genoma Café  para  identificação  e  caracterização  de  genes  que  codificam  a  enzima Galactinol  sintase,  e estudar a expressão desses genes em diferentes tecidos do cafeeiro. Material e Métodos Inicialmente foram feitas buscas dentro do banco de dados do Genoma Café (http:/www.lge.ibi.unicamp.br/café/), para o  gene Galactinol  sintase  (GolS).  Para  análise  e  caracterização,  foram  escolhidos  três  contigs  (CaGolS  1,  2  e 3),  os  quais mostraram  integridade  e  similaridade  com  o  gene GolS.  Esses  contigs  foram  formados  por  diferentes  tecidos  provenientes principalmente de plantas estressadas do cafeeiro. Foi utilizado o programa TargetP, o qual realiza a predição da existência de peptídeo  de  direcionamento  para  as  organelas,  e  SignalP  3.0,  que  prediz  a  existência e a posição de um peptídeo sinal em diferentes organismos. A fim de analisar as expressão dos genes CaGolS1, 2 e 3, foram construídos três pares de oligonucleotídeos, um par para cada gene, utilizando o programa PRIMER DESIGNER versão 2.0. Para extração de RNA total utilizou­se o protocolo de Chang et al. (1993) partindo­se de diferentes tecidos de cafeeiro, cultivar IAPAR 59,  sob condições de campo (folha,  raiz, ramo e botão floral) e o cDNA foi sintetizado a partir de 5 mg de RNA de todos os tecidos, utilizando o ThermoScript Ô oligo (dT) System (Invitrogen). Análise  por  reação  em  cadeia  da  polimerase  (PCR)  foi  realizada  para  todos  os  tecidos  utilizando  1mL  de  cDNAs sintetizados, 10 mM TRI­HCL pH8,4, 50mM de KCL, 2,5 mM MgCl2, 50 mM de cada dNTP, 1,0 U de Taq polimerase e 10 mM de  cada  iniciador  específico  para  o  gene CaGolS1,  2  e 3. A mistura  foi  submetida a 40 ciclos de amplificação, após a otimização da amplificação realizada para o gradiente de temperatura (48, 52, 54, 58 e 62°C) e na concentração de MgCl2 (1,5, 2 e 2,5 mM). O produto de amplificação do gene CaGolS3 foi isolado e clonado no vetor pCRÒ 2.1 – TOPO. Resultados e Discussão Foram  obtidas  91  seqüências  de  diferentes  bibliotecas  de  ESTs  depositadas  no  banco  do Genoma Café. Usando  o programa ClustalW (Thompson et al., 1994), foram gerados 11 contigs e 3 singlets. Para este estudo, os três contigs maiores (Tabela 1) foram selecionados por mostrarem integridade e similaridade com o gene de galactinol sintase (GolS) através de análises pelos programas BlastP e BlastX (Altschul et al,  1990). Tabela 1. Seqüências dos genes galactinol sintase identificados no Genoma Café CONTIGS  N° READS  BIBLIOTECAS CaGolS1  10  FR2, LV4, LV5, LV9, SH2 CaGolS2  6  AR1, LV5, SH2 CaGolS3  49  AR1, BP1, IA2, LV4, LV8, LV9, PC1, RM1 Bibliotecas: AR1= folhas tratadas com ácido araquidãnico; BP1= células suspensão, raiz e folha com bion; FR2 = botão floral estádio 1 e 2 – curta; IA2 = linhagem embriogênica (folha C. arabica) com indução por 2,4 D*; LV4 = folhas ponteiro ramo ortotrópico sem bion ­ longa; LV5 = folhas ponteiro ramo ortotrópico sem bion – curta; LV8 = folhas ramo plagiotrópico sem bion – longa (plantas adultas); LV9 = folhas ramo plagiotrópico sem bion – curta (plantas adultas); PC1= linhagem não embriogênica (folhas C. arabica) com indução por 2,4*; RM1 = folha infestada com bicho mineiro e infectada com ferrugem; SH2 = estresse hídrico campo (pool de órgãos e tecidos).As seqüências que participaram da formação dos contigs são provindas de diferentes tecidos do cafeeiro. O contig CaGolS1 foi formado por seqüências encontradas em bibliotecas de botão floral, folhas e folhas estressadas no campo. O contig é  composto  de  1005  pares  de  bases  (pb),  codificando para uma proteína de 335 aminoácidos. Quando BlastP  foi  realizado, observou­se a presença de um domínio da família de glicosil transferase (pfam01501) de 244 resíduos, o qual apresentou um alinhamento  de  100%  (e­value:  3e­45),  foi  observado  uma  alta  similaridade  com    as  seqüências  de  galactinol  sintase  de Brassica napus (341 aa), Arabidopsis thaliana (344 aa) com identidades de 79% e 75%, respectivamente e um  e­value: e­148 para ambas. O contig CaGolS2 foi formado por seqüências provindas tanto de folhas estressadas e não estressadas, é composto de  1026  pb  e  codificando  para  uma  proteína  de  341  aminoácidos.  A  seqüência  de  proteína  também  apresenta  o  domínio pfam01501, e um alinhamento de 100% (e­value: 2e­44). Análises de BlastP mostra uma alta similaridade com seqüências de galactinol  sintase  de  Cucumis  sativus  (331  aa),  75%  de  identidade  e  e­value:  1e­145;  Cucumis  melo  (331  aa),  75%  de identidade e e­value: 1e­145. O  contig  CaGolS3  foi  constituído  por  seqüências  provindas  de  células  suspensão  de  raiz  e  folhas,  células  não embriogênicas, células embriogênicas, raiz sem bion, e bibliotecas de folhas estressadas e não estressadas. O contig é formado de 1017 pb, codifica para uma proteína de 338 aminoácidos, apresenta o domínio da família de glicosil transferase pfam01501, com alinhamento de 100% e e­value: 2e­46.  Quando o BlastP foi realizado, alta similaridade foi observada com seqüências de galactinol synthase de Ajuga reptans (333 aa), 83% de identidade e e­value: 1e­167; Arabidopsis thaliana (334 aa), 82% de identidade e e­value: 1e­157. Análises  de  predição  da  existência  de  peptídeo  sinal  em  vários  programas  computacionais  realizadas  nas  três  seqüências preditas de proteínas GolS do cafeeiro não mostraram a presença de tais peptídeos para todas as seqüências analisadas. Os resultados das análises de RT­PCR de folhas são apresentados na Figura 1. Transcritos correspondentes a galactinol sintase  foram observados  somente  para  o  gene CaGolS3  em  três condições de  temperatura de anelamento  (52, 54 e 58°C), sendo  que  a  temperatura  ótima  ficou  estabelecida  em  54°C. O  produto  da  amplificação  obtido  foi  equivalente  a  1400  pb, tamanho correspondente ao gene GolS (Figura 1). A re­amplificação do produto de PCR nessa condição foi realizada para testar diferentes concentrações de MgCl2  (1,5, 2 e 2,5 mM), sendo o melhor resultado obtido na concentração de 2 mM. O produto resultante dessa re­amplificação foi isolado e clonado em vetor pCRÒ 2.1 – TOPO. O plasmídeo foi digerido com a enzima EcoRI que liberou um fragmento de aproximadamente 1400 pb, que estava de acordo com o tamanho esperado. Figura 1. Perfil eletroforético do teste de gradiente de temperatura para amplificação dos genes de galactinol sintase em folha do cafeeiro. A seta indica o fragmento de 1400 pb. M = marcador Ladder 1Kb; C1= oligonucleotídeo especifico para o gene CaGolS1; C2= oligonucleotídeo especifico para o gene CaGolS2; C3= oligonucleotídeo especifico para o gene CaGolS3; C= controle (gene constitutivo GOS); Branco= três amostras sem cDNA. A  expressão  dos  genes  CaGolS1  e CaGolS2  em materiais  sob  condições  de  campo não  foi  observada,  no  entanto, sugere  que  estes  genes  provavelmente  sejam  expressos  em  tecidos  do  cafeeiro  em  condições  de  estresse,  uma  vez  que  as seqüências  de  ESTs  que  formaram  esses  genes  são  provindas  principalmente  de  tecidos  estressados.  Sendo  assim,  serão realizados  experimentos  de  análise  de  expressão,  como RT­PCR e Northern blot para esses genes em  tecidos de plantas de cafeeiro submetidas ao estresse. 1 Kb M  54 º C 48 º C  52 º C  58 º C  62 º C  C  BrancoReferências bibliográficas Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. v. 215:403–410. Chang, S. Puryear J. Cairney, J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol Biol. v. 11, p.113 –116, 1993. Keller, F  Pharr, D.M. Metabolism of carbohydrates in sinks and sources: galactosyl­sucrose oligosaccharides. In E Zamski, AA Schaffer, eds, Photoassimilate Distribution in Plants and Crops: Source­Sink Relationships. Marcel Dekker, New York. p.157­183, 1996. Sprenger, N.  Keller,   F. Allocation of raffinose family oligosaccharides to transport and storage pools in Ajuga reptans: the roles of two distinct galactinol synthases. Plant J.  v. 21, p. 249­258, 2000. Taji, T. OhsumI, C. Iuchi, S. Seki, M. Kasuga, M. Kobayashi, M. YamaguchI­Shinozaki K, Shinozaki K. Important roles of drought­ and cold­inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant J.  v. 29, p. 417­ 426, 2002. Turgeon, R  Phloem loading and plasmodesmata. Trends Plant Sci. v. 1, p. 418­423, 1996. Thompson,  J.  D.,  Higgins,  D. G.,  Gibson,  T.  J.    CLUSTAL W:  improving  the  sesitivity  of  progressive multiple  sequence alignment through sequence weighting, positions­specific gap penalties and weigh matrix choice. Nucl. Acid. Res. v. 22, p. 4673­4680, 1994. Volk, G. M. Haritatos, E.E.  Turgeon, R. Galactinol synthase gene expression in melon.  J Am Soc Hortic Sci. v. 128, p. 8­15, 2003.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/909489/1/Identificacaoecaracterizacaodogene.pdf

Identificação e caracterização do gene galactinol sintase em Coffea arabica L.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa