Colletotrichum gloeosporioides sempre esteve associado ao sintoma de antracnose do cafeeiro, embora não tenha sido possível provar a sua patogenicidade à planta. Em 2010, de amostras de Coffea spp. do Espírito Santo e Bahia, foi isolado, além de C. gloeosporioides, um Colletotrichum com características morfológicas diferentes (colônia branca a róseo-alaranjada, com halos concêntricos escuros). A identificação da espécie foi feita pela amplificação da região ITS (internal transcribed spacer) do rDNA com o primer universal ITS4 em combinação com os primers CaInt2, CgInt e Col1, específicos para C. acutatum, C. gloeosporioides e C. boninense, respectivamente. Os primers ITS4 e Col1 amplificaram um produto único de aproximadamente 500pb, esperado para C. boninense. A região ITS do rDNA e o gene GAPDH do isolado do Espírito Santo foram amplificados pelos primers ITS1 e ITS4, e GDF e GDR, respectivamente. As sequências resultantes foram depositadas no GenBank com números de acessos JF683320 e JF331654, respectivamente, e analisadas filogeneticamente com outras espécies de Colletotrichum. A região do rDNA apresentou 99% de identidade com sequências de C. gloeosporioides e C. boninense. No entanto, a análise do gene GAPDH confirmou que o isolado era definitivamente C. boninense sensu lato, por se mostrar idêntico a outras sequências em um amplo clado de isolados da espécie. Para avaliar a patogenicidade de C. boninense ao cafeeiro foi usada uma suspensão de conídios a 106 conídios.mL-1 para inoculação em hipocótilos, com e sem ferimento. Trinta dias após a inoculação foi detectada necrose em 30% dos hipocótilos com ferimento. Folhas destacadas foram inoculadas com discos de micélio e apresentaram lesão sete dias após a inoculação, somente no tratamento com ferimento. No momento, estão sendo inoculados frutos verdes destacados de cafeeiro e os resultados sugerem a associação entre C. gloeosporioides e C. boninense no estabelecimento da doença. Este é o primeiro relato de C. boninense associado à antracnose do café no Brasil

CAIXETA, E. T.

FREITAS, R. L.

LELIS, D. T.

ZAMBOLIM, E. M.

ZAMBOLIM, L.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Colletotrichum gloeosporioides E C. boninense associados à antracnose do café no Brasil.

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 VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG Colletotrichum gloeosporioides E C. boninense ASSOCIADOS À ANTRACNOSE DO CAFÉ NO BRASIL   Rejane L. Freitas1; Eunize M. Zambolim2; Daniela T. Lelis1; Eveline T. Caixeta3; Laércio Zambolim4 1 Bolsista do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café – Consórcio Pesquisa Café, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, Viçosa- MG, rejbqi@yahoo.com.br, daniela_tlelis@yahoo.com.br 2 Pesquisadora, D. Sc., Universidade Federal de Viçosa, Viçosa- MG, eunize@ufv.br – autor para correspondência 3 Pesquisadora, D. Sc., Embrapa Café, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa- MG, eveline.caixeta@embrapa.br 4 Professor titular, PhD., Universidade Federal de Viçosa, Viçosa- MG, zambolim@ufv.br  RESUMO: Colletotrichum gloeosporioides sempre esteve associado ao sintoma de antracnose do cafeeiro, embora não tenha sido possível provar a sua patogenicidade à planta. Em 2010, de amostras de Coffea spp. do Espírito Santo e Bahia, foi isolado, além de C. gloeosporioides, um Colletotrichum com características morfológicas diferentes (colônia branca a róseo-alaranjada, com halos concêntricos escuros). A identificação da espécie foi feita pela amplificação da região ITS (internal transcribed spacer) do rDNA  com o primer universal ITS4 em combinação com os primers CaInt2, CgInt e Col1, específicos para C. acutatum, C. gloeosporioides e C. boninense, respectivamente. Os primers ITS4 e Col1 amplificaram um produto único de aproximadamente 500pb, esperado para C. boninense. A região ITS do rDNA e o gene GAPDH do isolado do Espírito Santo foram amplificados pelos primers ITS1 e ITS4, e GDF e GDR, respectivamente. As sequências resultantes foram depositadas no GenBank com números de acessos JF683320 e JF331654, respectivamente, e analisadas filogeneticamente com outras espécies de Colletotrichum. A região do rDNA apresentou 99% de identidade com sequências de C. gloeosporioides e C. boninense. No entanto, a análise do gene GAPDH confirmou que o isolado era definitivamente C. boninense sensu lato, por se mostrar idêntico a outras sequências em um amplo clado de isolados da espécie. Para avaliar a patogenicidade de C. boninense ao cafeeiro foi usada uma suspensão de conídios a 106 conídios.mL-1 para inoculação em hipocótilos, com e sem ferimento. Trinta dias após a inoculação foi detectada necrose em 30% dos hipocótilos com ferimento. Folhas destacadas foram inoculadas com discos de micélio e apresentaram lesão sete dias após a inoculação, somente no tratamento com ferimento. No momento, estão sendo inoculados frutos verdes destacados de cafeeiro e os resultados sugerem a associação entre C. gloeosporioides e C. boninense no estabelecimento da doença. Este é o primeiro relato de C. boninense associado à antracnose do café no Brasil. Palavras-chave: Patogenicidade, antracnose, Coffea arabica, Colletotrichum gloeosporioides, C. boninense. Colletotrichum gloeosporioides AND C. boninense ASSOCIATED WITH ANTHRACNOSE DISEASE OF COFFEE IN BRAZIL  ABSTRACT: Colletotrichum gloeosporioides has always been associated with anthracnose symptoms of coffee. However, it has not been possible to confirm its pathogenicity to the plant. In 2010, besides C. gloeosporioides, another fungus of the genus Colletotrichum showing distinct morphological characteristics (colonies white to orange-pinkish, with grey concentric haloes) was isolated from necrotic leaves and branches of Coffea canephora cv. Konillon in the Espirito Santo and Bahia State. The identification of the unknown Colletotrichum species was accomplished by amplifying the internal transcribed spacer (ITS) region from rDNA with the universal primer ITS4 in combination with the species-specific primers CaInt2, CgInt and Col1, for C. acutatum, C. gloeosporioides and C. boninense, respectively. The primers ITS4 and Col1 amplified a single DNA product of approximately 500bp, which is expected for C. boninense. Sequences data from the rDNA ITS region and from the Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene of the isolate from Espírito Santo were deposited in GenBank under the accession numbers JF683320 and JF331654, respectively. Those DNA sequences, as well as sequences from other Colletotrichum species were used for phylogenetic analysis. The ITS sequence showed an identity value of 99% with C. gloeosporioides and C. boninense sequences. On the other hand, analysis with GAPDH gene confirmed that the isolate is definitely C. boninense sensu lato, once it was exactly identical to other GAPDH sequences in a large clade of isolates from this species. The pathogenicity of C. boninense was evaluated by inoculating conidial suspension at 106 conidia/mL in wounded and non-wounded coffee hypocotyls. Thirty days after inoculation, necrosis was detected in 30% of wounded hypocotyls. Wounded detached leaves were inoculated with mycelia disks and they showed necrotic lesions seven days after inoculation. Detached green berries are currently being inoculated and the results suggest an association between C. gloeosporioides and C. boninense to establish the disease. This is the first report of C. boninense associated with anthracnose disease of coffee in Brazil. Key words: pathogenicity, anthracnose, Coffea arabica, Colletotrichum gloeosporioides, C. boninense.  Trabalho financiado pela Embrapa Café, CNPq e MAPA.  VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG INTRODUÇÃO  Em cafeeiro, os sintomas de antracnose como seca de ramos, folhas e frutos sempre foram associados à Colletotrichum gloeosporioides. Apesar disso, ainda não foi possível comprovar sua patogenicidade ao cafeeiro, uma vez que sintomas externos não aparecem após a inoculação. Diante desse fato, existe a hipótese de que C. gloeosporioides é um fungo endofítico e oportunista ao cafeeiro, podendo causar injúrias quando a planta é submetida a determinadas condições de estresse. Outra possibilidade é a existência de um complexo de diferentes espécies de Colletotrichum, responsável pelos sintomas observados em condições de campo. Neste sentido, torna-se importante a identificação de novas espécies do fungo e sua caracterização morfológica e molecular. Neste trabalho, relatamos a identificação de uma nova espécie de Colletotrichum associada à antracnose do café no Brasil e sua possível associação com C. gloeosporioides no estabelecimento da doença.  MATERIAL E MÉTODOS  Dois isolados de Colletotrichum, obtidos a partir de folhas de cafeeiro com sintomas de necrose no Estado do Espírito Santo, foram cedidos pelo Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural. Os isolados, denominados Incaper 13501 e Incaper 13422, apresentavam características similares às de C. gloeosporioides quando crescidos em meio de batata dextrose ágar (BDA). Outros isolados, com as mesmas características, foram obtidos a partir de ramos e frutos de cafeeiro, provenientes da Bahia, com sintomas característicos de infecção por C. gloeosporioides. Para a confirmação da espécie de Colletotrichum optou-se pela técnica de PCR (reação da polimerase em cadeia), utilizando o primer universal ITS4 (White et al., 1990) em combinação com CgInt (Mills et al., 1992), CaInt2 (Sreenivasaprasad et al., 1994) e Col1 (Pileggi et al., 2009), específicos para C. gloeosporioides, C. acutatum e C. boninense, respectivamente. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e visualizados pela coloração com brometo de etídio, seguido da exposição à luz ultravioleta.  Para o isolado Incaper 13422 foi feita a clonagem e o sequenciamento dos genes β-tubulina e GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) e da região ITS (internal transcribed spacer) do rDNA. A busca de similaridade local entre as sequências consenso de interesse e sequências depositadas em banco de dados foi feita por meio do aplicativo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponível no site do NCBI. A caracterização morfológica de C. boninense foi feita com colônias crescidas em BDA, a 25ºC e fotoperíodo de 12h, por sete dias. Os conídios foram espalhados em lamínulas, contendo 15µL de água esterilizada, e incubados em câmara úmida por 48h. Após esse tempo, as lamínulas foram montadas em lâminas com lactofenol e observadas ao microscópio de luz. A medição do tamanho dos conídios e dos apressórios foi feita com auxílio de uma régua presente na ocular do microscópio. A fim de confirmar a patogenicidade de C. boninense (Incaper 13422), hipocótilos de C. arabica no estádio palito de fósforo foram inoculados com suspensão de conídios (concentração de 2x106 conídios.mL-1), acrescida de Tween 0,01%, com e sem ferimento, utilizando um atomizador De Vilbiss. Como testemunha foi utilizada água esterilizada + Tween 0,01%.  As bandejas foram envoltas por saco plástico e mantidas a 19ºC, no escuro, por 48 horas. Após esse tempo, uma nova suspensão foi preparada e os hipocótilos foram reinoculados. As bandejas foram novamente cobertas e mantidas a 22ºC e fotoperíodo de 12h, até aparecimento de sintomas. Foram também inoculadas folhas jovens de C. arabica, com e sem ferimento, utilizando-se discos de micélio do isolado Incaper 13422. Como testemunha, utilizou-se disco de meio BDA.  A possível associação entre C. gloeosporioides e C. boninense foi avaliada pela inoculação de frutos verdes destacados de cafeeiro. Os frutos foram desinfestados superficialmente, acondicionados em gerbox e inoculados com 20 µL da suspensão de conídios (concentração de 2x106 conídios.mL-1), acrescida de Tween 0,01%, com e sem ferimento. Após 48h, foi feita a reinoculação dos frutos, compondo cinco tratamentos: 1) testemunha (água esterilizada); 2) C. gloeosporioides (1a e 2a inoculação); 3) C. boninense (1a e 2a inoculação); 4) C. gloeosporioides (1a) + C. boninense (2a); 5) C. boninense (1a) + C. gloeosporioides (2a). A avaliação está sendo feita diariamente e os frutos lesionados estão sendo utilizados para reisolamento do fungo.   RESULTADOS E DISCUSSÃO  Com exceção de dois isolados (Incaper 13422 e um isolado de ramo da Bahia), todos os demais foram confirmados como C. gloeosporioides. A ausência de banda para os dois isolados descartou a possibilidade de serem C. gloeosporioides ou C. acutatum. A partir daí, a estratégia adotada foi a clonagem de alguns genes para posterior sequenciamento, na tentativa de identificar a espécie. Para este trabalho, foi utilizado o isolado Incaper 13422. Os resultados de BLAST obtidos com as sequências do isolado Incaper 13422 estão ilustrados na Figura 1. Com o gene β-tubulina foi observada uma identidade de 91% com sequências de C. gloeosporioides e de Glomerella acutata, 90% com C. kahawae e 89% com C. graminicola. Para a região ITS foi verificada uma alta identidade (99%) tanto com sequências de C. gloeosporioides quanto de C. boninense. O gene GAPDH, por sua vez, apresentou alta identidade (98%) apenas com sequências de C. boninense.    VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG          Figura 1 – Resultados obtidos na análise de BLAST com as sequências de β-tubulina (A), ITS (B) e GAPDH (C), mostrando a porcentagem de identidade (Max Ident) do isolado Colletotrichum spp. Incaper 13422 com sequências depositadas em banco de dados.   O relacionamento filogenético entre o isolado Incaper 13422 e outros isolados de C. boninense, inferido a partir do gene GAPDH, confirmou que o isolado é definitivamente C. boninense sensu lato, por se mostrar idêntico a outras sequências em um amplo clado de isolados desta espécie (Figura 2). De fato, a amplificação de um produto único com a combinação dos primers específicos ITS4 e Col1 confirmou o isolado Incaper 13422 e o isolado da Bahia como C. boninense. Novamente, não houve a amplificação esperada para as outras espécies de Colletotrichum (Figura 3). Além da confirmação molecular, foi feita a caracterização morfológica do fungo. As colônias apresentaram coloração branca a róseo-alaranjada, com halos concêntricos escuros devido à abundante formação de esporodóquios, com massa de conídios alaranjada, reverso alaranjado (Figura 4, A e B). Os conídios (amerosporos) eram hialinos e elipsóides, de 10-16 x 5.0-7.5 µm. Os apressórios com poro germinativo eram melanizados, apresentando formato irregular e espatulado (Figura 4, C), de 7.5-11.0 x 5.5-8.5 µm, formados sozinhos ou associados (Figura 4, D).    A B C  VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG  Figura 2 - Árvore filogenética inferida a partir do gene GAPDH, ilustrando o relacionamento entre o isolado Incaper 13422 e outros isolados de C. boninense. .  Figura 3 – Produto amplificado por meio de reação de PCR, utilizando o primer universal ITS4 em combinação com os primers CaInt2, CgInt e Col1, específicos para C. acutatum, C. gloeosporioides e C. boninense, respectivamente. M representa o marcador de peso molecular. A seta indica a banda de 500pb. (+) se refere ao controle positivo usado nas diferentes reações. (1): DNA do isolado Incaper 13422. (2): DNA do isolado da Bahia.    VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG  Figura 4 – Características morfológicas de C. boninense. Cultura crescida em BDA, aos sete dias, apresentando halos concêntricos, com abundante esporulação (A) e reverso alaranjado (B). Conídios hialinos e elipsóides, com apressórios melanizados (C), formados sozinhos ou associados (D).   A patogenicidade de C. boninense foi avaliada em hipocótilos e folhas destacadas de cafeeiro. Aos 30 dias após a inoculação (dai), foi detectada necrose em 30% dos hipocótilos com ferimento (dados não mostrados). Nas folhas inoculadas foi possível observar necrose uma semana após a inoculação, mas apenas no tratamento ‘com ferimento’ (Figura 5). Convém salientar que estes experimentos foram realizados anteriormente com vários isolados de C. gloeosporioides existentes no laboratório, embora não tenha sido verificado qualquer sintoma.    Figura 5 – Patogenicidade do isolado Incaper 13422 em folhas destacadas de C. arabica. Folhas inoculadas com disco de BDA (testemunha, à esquerda) e com disco de micélio do isolado Incaper 13422 (à direita). Uma semana após a inoculação, as folhas inoculadas com o isolado apresentavam necrose, apenas no tratamento ‘com ferimento’.   Os resultados obtidos com a inoculação de C. boninense e C. gloeosporioides em frutos verdes de cafeeiro sugerem a associação das duas espécies no estabelecimento da doença, uma vez que não houve lesão nos frutos inoculados apenas com uma das espécies. Aos 15 dai, foi verificada uma alta taxa de necrose (70%) nos frutos inoculados primeiramente com C. boninense e após 48h, com C. gloeosporioides, mas apenas no tratamento com ferimento (Figura 6 B). Curiosamente, não houve lesão nos frutos inoculados primeiro com C. gloeosporioides e depois  VII Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil 22 a 25 de Agosto de 2011, Araxá ‐ MG com C. boninense, mantendo-se similar à testemunha (Figura 6 A). Estas observações dão suporte à hipótese de que C. gloeosporioides é um fungo oportunista e que atua em associação com outras espécies de Colletotrichum para causar danos ao cafeeiro. Trabalhos complementares serão realizados a fim de esclarecer essa questão.         Figura 6 – Patogenicidade das espécies de Colletotrichum em frutos verdes destacados de C. arabica. A- Frutos inoculados com água esterilizada (testemunha), com ferimento. B- Frutos inoculados com C. boninense (1a) + C. gloeosporioides (2a), com ferimento, aos 15dai.   CONCLUSÕES  1- O isolado oriundo de C. canephora foi identificado com base em características morfológicas e moleculares. A análise do gene GAPDH confirmou que o isolado era definitivamente C. boninense sensu lato, por se mostrar idêntico a outras sequências em um amplo clado de isolados da espécie. 2- C. boninense está associado à antracnose do cafeeiro no Brasil, tendo sido capaz de infectar hipocótilos e folhas destacadas de cafeeiro, mas apenas ‘com ferimento’.  3- Frutos verdes destacados de cafeeiro somente apresentaram lesão após inoculação de C. boninense seguida de C. gloeosporioides, no tratamento com ferimento. O inverso não ocorreu. 4- Os dados sugerem que C. gloeosporioides é um fungo oportunista e que atua em associação com outras espécies de Colletotrichum em folhas e frutos do cafeeiro.   REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  MILLS, P. R., SREENIVASAPRASAD, S., BROWN, A. E. Detection and differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates using PCR. FEMS Microbiology Letters, 98:137-143, 1992. PILEGGI, S. A. V. et al. Molecular and morphological markers for rapid distinction between 2 Colletotrichum species. Canadian Journal of Microbiology, 55:1076-1088, 2009. SREENIVASAPRASAD, S., SHARADA, K., BROWN, A. E., MILLS, P. R. PCR-based detection of Colletotrichum acutatum on strawberry. Plant Pathology, 45: 650-655, 1996.  WHITE, T. J., BRUNS, T. D., LEE, S., TAYLOR, J. W. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, CA.  pp. 315–322, 1990.  

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/903981/1/Colletotrichumgloeosporioides.pdf

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