O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar primers para serem usados em reações de RAPD para futuras análises de diversidade genética em canafístula

LIMA, P. S. da C.

NASCIMENTO, M. P. S. B. C. do

SANTOS, M. F. dos

SOUZA, I. G. B. de

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    ________________ 1. Mestranda em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI. E-mail: michelly_m_santos@yahoo.com.br 2. Mestranda em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI. E-mail: isisgomesmd@hotmail.com 3 .Pesquisadora Embrapa Meio-Norte, Teresina, PI. E-mail: sbona@cpamn.embrapa.com.br 4. Pesquisador Embrapa Meio-Norte, Teresina, PI. E-mail: sarmanho@cpamn.embrapa.com.br  Apoio financeiro: Trabalho realizado com recursos da Embrapa Introdução As espécies lenhosas são fundamentais no contexto de produção e disponibilidade de forragem no Semi-árido Nordestino, merecendo destaque a canafístula (Senna spectabilis (DC) H.S. Irwin & Barneby). À medida que a estação seca progride e com o aumento da disponibilidade de folhas secas de árvores e arbustos, esta espécie se torna cada vez mais importante na dieta, principalmente dos caprinos (ARAÚJO FILHO et al., 1995). Segundo Lacerda e Kageyama (2003), o desenvolvimento de estratégias para a conservação genética de uma espécie passa pelo estudo da distribuição da variabilidade genética entre e dentro de suas populações. As características morfológicas são muito utilizadas para a caracterização de uma espécie, mas os marcadores moleculares fornecem uma abordagem mais específica de cada indivíduo e são muito mais eficientes para a determinação da variabilidade genética, por analisarem diretamente o material genético (YANAKA et al., 2005). A caracterização genética é importante para os programas de conservação de recursos genéticos vegetal, pois avalia a distância entre as populações em estudo e pode auxiliar na escolha das espécies a serem utilizadas na conservação mediante a estimativa de índices de similaridade entre os indivíduos analisados.  (MOREIRA, 2001).  Entre os marcadores moleculares baseados em PCR (Polymerase Chain Reaction), a técnica RAPD (Random Amplified Polymorfhic DNA) tem sido mais utilizada na análise da diversidade genética de populações naturais, populações de melhoramento e em acessos de bancos de germoplasma, por ser considerada de custo mais baixo (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Outra vantagem da técnica RAPD é que os primers utilizados podem encontrar, aleatoriamente, regiões de homologia no DNA e, portanto, não necessita do conhecimento prévio de seqüências do genoma a ser analisado (CAIXETA et al., 2003). O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar primers para serem usados em reações de RAPD para futuras análises de diversidade genética em canafístula.  Material e Métodos Foram coletadas folhas jovens de oito acessos de canafístula, oriundos do banco de germoplasma de forrageiras da Embrapa Meio-Norte, em Teresina, PI. Foram realizadas extrações de DNA genômico de tecido foliar jovem de plantas de canafístula. A quantificação foi realizada em gel de agarose a 0,8% com TBE (Tris-Borato-EDTA) 0,5 x corado com SYBR® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen), comparando-se o DNA das amostras com o DNA - λ na concentração de 150 ng. Foram testados 100 primers e as reações de amplificação foram preparadas em volume final de 20 µl contendo 15 ng de DNA, 0,25 mM de dNTP, 1U de TaqPolimerase (Invitrogen), 0,2 μM de primer, 3,0 mM de MgCl2, 2,0 µl l de tampão 1X e H2O ultrapura. Essas reações foram realizadas com uma etapa inicial de desnaturação de 1 min a 92ºC, seguida de 45 ciclos de 1 min a 92°C para desnaturação, 1 min a 35°C para anelamento, 2 min a 72°C e uma extensão final de 5 min a 72°C. Os produtos das reações foram visualizados em gel de agarose a 1,5%, corado com SYBR® Safe DNA Gel Stain a (Invitrogen) e fotodocumentados sob luz ultravioleta.  Resultados   Dos100 primers de RAPD testados 18 foram selecionados (A07, A12, B04, M01, M02, M04, M05, M07, M09, M15, M16, M17, M19, M20, N06, N10, N12, N14), por serem mais informativos e produzirem bandas (produtos de amplificação) mais nítidas. Foram obtidas 93 bandas, sendo 43 polimórficas e 50 monomórficas (Tab. 1). A Fig. 1 ilustra o padrão de bandas obtido em dois acessos de canafístula (C1 e C2), com os 18 primers selecionados. Discussão A técnica de RAPD mostrou-se eficiente na detecção de polimorfismos nos acessos de Seleção de primers RAPD para análise de diversidade genética em canafístula (Senna spectabilis)  Michelli Ferreira dos Santos1, Isis Gomes Brito de Souza2, Paulo Sarmanho da Costa Lima3 e Maria Perpetuo Socorro Bona Cortez do Nascimento 4  canafístula. A Tabela 1 apresenta os primers selecionados e o respectivo número de bandas polimórficas obtidas, observando-se variação de 1 a 5. Os resultados obtidos indicam a presença de variabilidade e que os marcadores RAPD tem potencial para a caracterização molecular dos acessos do banco de germoplasma de canafístula da Embrapa Meio-Norte.   Referências ARAÚJO FILHO, J.A. de. 1985. Pastoreio múltiplo. In: SIMPÓSIO SOBRE MANEJO DE PASTAGENS, 7.,Piracicaba, 1985. [Anais]. Piracicaba: FEALQ, 1985. p. 209-233. CAIXETA, R. P. et al. Variação genética em populações de Eucalyptus spp. detectadas por meio de marcadores moleculares. Revista Árvore, v.27, n.3, p.357-363, 2003. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3.ed.Brasília: Embrapa-Cenargen, 1998. 220p LACERDA, C. M. B.; KAGEYAMA, P. Y. Estrutura genética de duas populações naturais de Myracrodruon urundeuva M. Allemão na Região Semi-árida, Brasil. Revista Árvore, v.27, n.2,p.145-150, 2003 MILACH, S. Principais tipos de marcadores moleculares e suas características. In: MILACH, S.C.K. (Ed.). Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre: Sandra Milach, 1998.p. 17-28. YANAKA, F. Y. et al. Variabilidade genética em populações naturais de Bromus auleticus Tris. Ex Ness (Poaceae) com base em isoenzimas e marcadores RAPD. Revista Brasileira de Zootecnia, v.34, n.6, p.1897-1904, 2005.  Tabela 1. Número de bandas polimórficas, monomórficas e total de bandas por iniciador usado na caracterização da variabilidade genética em canafístula. Primer Seqüência de Nucleotídeos Total de bandas polimórficas Total de bandas monomórficas Total de bandas A07 5’ GTA ACC AGC  C 3’  1 5 6 A12 5’ TCG GCG ATA  G 3’ 2 3 5 B04 5’ GGA CTA GAG  T 3’ 3 3 6 M01 5’ GTT GGT GGC   T 3’ 2 3 7 M02 5’ ACA ACG CCT  C 3’ 1 3 4 M04 5’ GGC GGT TGT  C 3’ 5 2 7 M05 5’ GGG AAC GTG  T 3’ 2 4 6 M07 5’ CCG TGA CTC  A 3’ 2 1 3 M09 5’ GTC TTG CGG  A 3’ 2 2 4 M15 5’ GAC CTA CCA  C 3’ 4 2 6 M16 5’ GTA ACC AGC  C3’ 2 5 7 M17 5’ TCA GTC CGG  G 3’ 4 1 5 M19 5’ CCT TCA GGC  A 3’ 2 3 5 M20 5’ AGG TCT TGG  G 3’ 1 2 3 N06 5’ GAG ACG CAC  A 3’ 4 4 8 N10 5’ ACA ACT GGG  G 3’ 1 2 3 N12 5’ CAC AGA CAC  C 3’ 3 2 5 N14 5’ TCG TGC GGG  T 3’ 2 2 4                                              Figura 1. Perfil eletroforético dos produtos de amplificação gerados pelos primers selecionados para estudos de variabilidade genética em canafístula.  

Seleção de primers RAPD para análise de diversidade genética em canafístula (Senna spectabilis).

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