COSTA, M. R.

LAMEIRA, O. A.

YOSBINO, V. C.

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

Caracterização genética do Curauá (Ananas erectifolius) através de marcadores RAPD.

O objetivo deste estudo foi examinar o polimorfismo gerado por marcadores RAPD e analisar a diversidade genética entre acessos de curauá pertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Embrapa Amazônia Oriental

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28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002Caracterização genética do Curauá(Ananas erectifolius)através de Marcadores RAPDPesquisaCaracterização e uso de recursos genéticos vegetais na Amazônia OrientalFotos cedidas pelos autoresMaria Rosa CostaEng.Agro.,M.Sc. emGenéticaEmbrapa Amazônia OrientalBelém  PAmrco@cpatu.embrapa.brimportância das plantasdoadoras de fibra na fabri-cação de utensílios é co-nhecida desde as épocasremotas pelas comunida-des indígenas. SegundoMedina (1959),esse grupo de plantas é o segundo emimportância para o homem depois dasespécies alimentares. Na Amazônia,várias são as espécies produtoras defibras e segundo Oliveira et al. (1987),somente na microrregião do salgadoParaense existem 17 espécies de plan-tas fibrosas, com utilização atual.O Estado do Pará, em seu passadorecente, tem tradição no cultivo deplantas produtoras de fibras, tal comoa malva e a juta, tendo a Amazôniainúmeras plantas com possibilidadesreais de aproveitamento na indústriatêxtil. Nesse contexto, o curauá (Ananaserectifolius), planta pré-colombiana, utili-zada principalmente na fabricação de cor-das, sacos e utensílios domésticos, des-ponta como sucedâneo para o aproveita-mento de fibras.O curauá é uma bromeliácea distribu-ída nos Estados do Pará (Rios Xingu, To-cantins, Trombetas, entre outros), Acre,Mato grosso, Goiás e Amazonas e é culti-vada principalmente por pequenos pro-dutores da região do Lago Grande deCuruai, no Município de Santarém. Estu-dos recentes têm demonstrado o grandepotencial dessa planta como produtora defibra de excelente qualidade, podendo serutilizadana indústria automobilística, devi-do à sua resistência, maciez e peso redu-zido. Há crescente demanda de fibras docurauá por grupos empresariais preocu-pados, principalmente com a utilização deprodutos naturais biodegradáveis, o quetorna essa espécie estratégica para o Esta-do e cria uma perspectiva de melhoria daqualidade de vida dos pequenos produto-res (Ledo, 1967).Segundo Ledo (1967), há ocorrênciadedois tipos de curauá: umde folhas roxo-avermelhadas, que se desenvolve mais,chamadode curauá roxo; e outro de folhasverde-claras, conhecido por curauá bran-co. Algumas das diferenças entre os doistipos de curauá residem não só na colora-ção da folha, mas na resistência e namaciez das fibras, no porte da planta e naquantidade de rebentos e filhos. Outradiferença encontrada nos plantios de cu-rauá é a ocorrência, em algumas plantas,de espinhos foliares, que aparecem quan-do a planta entra no processo de envelhe-cimento.No Estado do Pará, o curauá ocorreprincipalmente nos Municípios de Santa-rém e Bragança, e a Embrapa AmazôniaOriental, por intermédio do seu Laborató-Tabela1 - Identificação dos acessos analisados. Belém, PA, 2001.1Origem-BrasilN0C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12C13C14C15C16LocalidadeSantarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Cultura de Tecidos1PontadePedras,PA1PontadePedras,PA1Santarém,PA1Santarém,PA1Bragança,PA1Bragança,PA1Cultivar/variedadeTanakaRoxoTanakaBrancoMarildaBrancoAraçariBrancoAraçariRoxoBomFuturoBrancoBomFuturo RoxoCentrinhoBrancoCentrinhoRoxoEmbrapa/cpatuRoxoSolteiraBrancoPonta dePedraBrancoDiamantinaBrancoDiamantinaRoxoBragançaBrancoBragançaRoxoFigura 1 - Eletroforese do RAPDem curauá gerado pelo primerOPAZ 14. A primeira e a últimacolunas correspondemaomarcador Ladder e as demais,aosgenótiposanalisadosOsmar Alves LameiraEng. Agro., Dr. emBiotecnologiaEmbrapa Amazônia OrientalBelém  PAViviane Castro YoshinoBolsita PIBICCNPq/FCAPEmbrapa AmazôniaBelém  PABiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 29rio de Biotecnologia de Plantas, realizouuma coleta da espécie naqueles locaispara a formação de um Banco Ativo deGermoplasma para trabalhos de propa-gação in vitro, caracterização moleculare melhoramento genético da cultura. Osestudos de caracterização, através demarcadores moleculares em associaçãocom avaliação da divergência genéticanessa espécie, são bastante limitados ouinexistem. Esse trabalho é consideradoprioritário, devido à demanda existentepara se quantificar a variabilidade gené-tica dos acessos; para verificar a similari-dade entre eles a fim de sanar dúvidasquanto à origem e uso nos cruzamentos,além de para auxiliar na escolha deacessos potenciais para o enriquecimen-to da variabilidade genética no próprioBanco Ativo de Germoplasma. Apesarda reconhecida variabilidade fenotípicaexistente nesses bancos, o germoplas-ma de curauá tem sido pouco estudadosob o ponto de vista genético. O usocombinadodemarcadoresmorfológicose moleculares subsidiará os trabalhos demelhoramento, em busca de cultivaresmais produtivos e com características dequalidade que atendam demandas dosetorprodutivo, contribuindo, ainda,parao intercâmbio de material e de informa-ções entre instituições de pesquisa.Assim, o objetivo deste estudo foiexaminar o polimorfismo gerado pormarcadores RAPD e analisar a diversida-de genética entre acessos de curauápertencentes ao Banco Ativo de Germo-plasma (BAG) da Embrapa AmazôniaOriental.Material e MétodosGermoplasmaO material investigado foi compostode 16 acessos de curauá provenientesdo Banco Ativo de Germoplasma daEmbrapa Amazônia Oriental, em Be-lém, PA (Tabela1).RAPDO DNA genômico foi obtido atra-vés de folhas em estádio médio dedesenvolvimento, recém-coletadasque, após desinfecção, foram macera-das com nitrogênio líquido, e cerca de200 mg de pó foram transferidos paratubos eppendorf. Adicionou-se, emseguida, 700 µl de solução extratora.Os tubos foram vortexados e coloca-dos em banho-maria a 60 0C durante 60minutos. O extrato foi misturado com700 µl de clorofórmio-álcool isoamil(24:1) para formar uma emulsão. Apóscentrifugar por 10 minutos a 4 0C e12.000 rpm, a parte superior aquosafoi cuidadosamente isolada e submeti-da a álcool 95%, o que ocasionou aprecipitação do DNA. O material foicolocado em freezer (-20 0C) por 20minutos, sendo, em seguida, centrifu-gado por 10 minutos a 4 0C e 12.000rpm, lavado com 1000 µl de etanol70%, para remover sais e, posterior-mente, foi secado a temperatura ambi-ente, por, aproximadamente, 12 ho-ras. O DNA foi ressuspendido com 100µl RNAse/ TE (10ug.ml-1). A concentra-ção de DNA foi estimada em gel deagarose 1,0%pela comparaçãodoDNAtotal com três concentrações do DNAlambda.AsamostrasutilizadasnoRAPD,após a quantificação, partiram de dilui-ções da amostra total em água estéril,de modo a conter 5 ng/µl de DNA. Asalíquotas foram armazenadas a 20 0C.Osprimers utilizados foram:OPS03,OPN15, OPN09, OPN02, OPAZ16,OPAZ14 e OPAZ03.As reações foram desenvolvidas deacordo com o protocolo deWilliams etal. (1990), com pequenas modifica-ções, num volume final de 13 µl con-tendo água destilada autoclavada, 20mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 2,0mMMgCl2, 200 µMde cada dNTP, BSApurificada (2,5 mg/ml), 1,3 uM primerarbitrário, 1U.I Taq DNA polimerase e15 ng de DNA genômico, cobertascom duas gotas de óleo mineral.As amplificações foram realizadasem termociclador de DNA Thermoly-ne Amplitron II, modelo DB.80225,sendo realizados 40 ciclos de 1 a 94 0C;1 a 37 0C; e 2 a 72 0C, seguidos de mais7 a 720 C para a completa extensãodos produtos amplificados. O métodoutilizado para a separação dos produ-tos amplificados foi a eletroforese ho-rizontal, em gel de agarose 1,5%, cora-do com brometo de etídio 1mg/ml.Utilizaram 13 µl de cada reação, acres-cidos de 2µl de uma solução de azul debromofenol (40 %) mais sacarose. Uti-lizou-se TBE (Trizma base 0,1 M; ácidobórico 1M e EDTA 0,5M) como tam-pão do gel e de corrida.Após a eletroforese, os géis foramvisualizados e fotografados em equi-pamento de foto documentação, portransiluminação em ultravioleta.Aplicou-se um ladder de 1Kb noinício e no final do gel para definir otamanho aproximado dos fragmentosgerados nas PCRs.Inicialmente, construíu-se umama-triz para os fragmentos polimórficosamplificados com presença (1) e au-sência de banda (0). Somente foramconsideradas as bandas quenãodavammargens a dúvidas. Bandas muito fra-cas, de difícil resolução, não foramincluídas. Para análise dos dados, utili-zou-se o NTSYS-pc (Numerical Taxo-nomy and Multivariate Analysis Sys-tem), versão 2.02. A similaridade entreas amostras foi estimadapelocoeficiente de Jaccard, quegerou amatriz de similarida-de. A partir dessa matriz, foigerado o cluster, pelo méto-do UPGMA (UnweightedPair-GroupMethodUsingAri-thmetic Average), que foiexpresso na forma de umdendograma (Fig.3).Resultados e DiscussãoUm total de 104 marca-dores RAPD, com tamanhosvariando de 300pb a 2.200Figura 2 -Matriz de distância genética estimada pelo coeficiente de Jaccardpara todosos indivíduosanalisados30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002pb, foram amplificados pelos sete pri-mers utilizados, dos quais 79 eram po-limórficos, gerando 75,96 % de poli-morfismo. O número de marcadoresamplificados variou de 20 (OPN-02) a12 (OPN-09). O número de fragmentospolimórficos por primer variou de 16(OPN-02) a 8 (OPN-15). Observou-seentreos fragmentos amplificados aocor-rência de bandas específicas aos indiví-duos. Na Fig.1, visualizam-se exemplosdesses marcadores. Estimaram-se os ín-dices de similaridade para todos osindivíduos analisados (Fig.2). A maiordistância foi obtida comparando-se oC4com o C14 (12 %). O segundo maiordistanciamento genético foi entre oacesso C2 com o C14 e o C16 (14%);C2 com o C7 (17%) e C2 com o C10(18%). Isso indica que esses acessossão candidatos potenciais, como fontede variabilidade, noprogramadehibri-dização dessa espécie, visando ao me-lhoramento genético. Por outro lado, amaior similaridade genética foi entre oC11 e o C13 (80%).Na Fig.3, encontra-se o dendogra-ma, gerado pelométodoUPGMA, atra-vés do programa NTSYS-pc, 2.02. Essaanálise de distância genética gerou ocluster, que mostra a separação dosacessos em dois grupos principais. Noprimeiro grupo, que se subdividiu emdois subgrupos, com coeficiente desimilaridade, variando de 12% a 80%,incluem-se 14 materiais, oriundos de di-ferentes localidades. No segundo grupo,encontram-se dois materiais com simila-ridade genética de 51%. Os acessos C1,C6 e C14 foram distintos em relação aorestante, constituindo subgrupos isola-dos dentro do seu grupo. Observou-segrande divergência em alguns materiais,oriundos damesma localidade, concluin-do-se haver pouca relação entre a ori-gem geográfica e o padrão da distribui-ção da variabilidade genéticaobtida.Observou-se que, nesse caso, osmarcadores RAPD foram eficientes naseparação dos acessos de acordo com acoloração, fornecendo resultados simila-res aos obtidos a partir de característicasmorfo-agronômicas.ConclusõesOs marcadores RAPD mostraram-seeficientesparadetectar polimorfismones-sa espécie e podem ser utilizados comouma poderosa ferramenta na obtençãode informações úteis para o manejo doBanco de Germoplasma e para o direci-onamento de programas de melhora-mento genético.Observou-se que a avaliação da di-vergência genética feita por marcadoresRAPD foi similar à obtida pelas caracterís-ticas morfológicas, separando os acessospela coloração.Referências BibliográficasLEDO, I. A. de M. O cultivo do curauáno lago grande de Franca. Belém:BASA, 1967. 23 p.MEDINA, J. C. 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