A bacaby (Oenocarpus mapora) é uma palmeira produtora de frutos que produzem óleo excelente qualidade e refresco de alto valor nutricional. A seleção de primers RAPD foi realizada visando à análise de divergência genética entre acessos do Banco de Germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. Foram testados 106 primers RAPD em cinco genótipos de O. mapora. 65,1% dos primers foram polimórficos, os quais geraram 307 bandas, com 71,3% delas polimórficas. Dos primers testados, 24 foram selecionados para a análise de divergência genética, os quais apresentaram boa amplificação e considerável polimorfismo. Os primers selecionados foram: OPA-04, OPA-06, OPA-12, OPAB-01, OPAB-02, OPAB-11, OPAB-12, OPAB-19, OPAZ-04, OPAZ-11, OPAR-07, OPB-11, OPJ-12, OPM-07, OPN-11, OPO-03, OPO-12, OPO-16, OPU-01, OPU-06, OPU-16, OPU-17, OPS-13, OPS-15

COSTA, J. R. S. da

MOURA, E. F.

OLIVEIRA, M. do S. P. de

OLIVEIRA, N. P. de

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

   SELEÇÃO DE PRIMERS RAPD PARA CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA EM  Oenocarpus mapora  Jean Roberto Silva da Costa1, Elisa Ferreira Moura2, Maria do Socorro Padilha de Oliveira3, Natália Padilha de Oliveira4  Resumo   A bacaby (Oenocarpus mapora) é uma palmeira produtora de frutos que produzem óleo de excelente qualidade e refresco de alto valor nutricional. A seleção de primers RAPD foi realizada visando à análise de divergência genética entre acessos do Banco de Germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. Foram testados 106 primers RAPD em cinco genótipos de O. mapora. 65,1% dos primers foram polimórficos, os quais geraram 307 bandas, com 71,3% delas polimórficas. Dos primers testados, 24 foram selecionados para a análise de divergência genética, os quais apresentaram boa amplificação e considerável polimorfismo. Os primers selecionados foram: OPA-04, OPA-06, OPA-12, OPAB-01, OPAB-02, OPAB-11, OPAB-12, OPAB-19, OPAZ-04, OPAZ-11, OPAR-07, OPB-11, OPJ-12, OPM-07, OPN-11, OPO-03, OPO-12, OPO-16, OPU-01, OPU-06, OPU-16, OPU-17, OPS-13, OPS-15.    Introdução  Oenocarpus mapora, conhecida como bacaby, é uma palmeira nativa da Amazônia que produz frutos cujas polpas podem ser utilizadas na produção de refresco, geléias e óleo comestível semelhante ao do azeite de oliva, além das amêndoas permitirem a extração de óleo com a mesma característica. Essa palmeira é bastante empregada por comunidades que moram próximas aos locais com alta densidade da espécie e, apesar de produzir refresco com qualidades e uso similar ao do açaizeiro (Euterpe oleracea), seu mercado ainda é local. O consumo dos frutos na forma natural ou processada serve como complemento nutricional, além de gerar divisas com a venda desses produtos.   A possibilidade de manter uma parte da variabilidade genética da espécie em foco em banco de germoplasma reduz os riscos de perda por degradação ambiental. Para que isso seja realizado de maneira proveitosa, a etapa de avaliação da amostra de variabilidade genética torna-se primordial para o estabelecimento de estratégias de coleta, conservação e manejo.  Marcadores moleculares são ferramentas úteis na quantificação da variabilidade, pois apresentam a vantagem de não sofrerem influência ambiental e serem capazes de amostrar uma porcentagem maior do genoma em comparação aos marcadores fenotípicos (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Os marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), foram descritos por Williams et al. (1990) e têm a vantagem de serem pouco onerosos e possuírem alto grau de polimorfismo.  Para realizar as reações de RAPD, se faz necessário uma seleção prévia de primers. O sucesso na aplicação desses marcadores depende de boa amplificação e da geração de polimorfismo. Com base nessa premissa o objetivo desse trabalho foi realizar a seleção de primers RAPD para O. mapora.     ________________ 1.. Primeiro Autor é aluno de graduação em Licenciatura em Biologia, Universidade Federal de Pará e Bolsista da Embrapa Amazônia Oriental, Trav. Enéas Pinheiro s/n, Belém, PA, CEP: 66095-100. E-mail: jeancosta_bio@yahoo.com.br  2. Segundo Autor é Bolsista de Desenvolvimento Científico Regional do convênio CNPq/FAPESPA, Embrapa Amazônia Oriental, Trav. Enéas Pinheiro s/n, Belém, PA, CEP: 66095-100. E-mail: ferrmoura@hotmail.com 3. Terceiro Autor é Pesquisador A da Embrapa Amazônia Oriental, Trav. Enéas Pinheiro s/n, Belém, PA, CEP: 66095-100. E-mail: spadilha@cpatu.embrapa.br.  4. Quarto Autor é aluno de graduação em Licenciatura em Biologia, Universidade Federal de Pará, Bolsista do CNPq, Belém, PA, CEP 66095-100. E-mail: natybiologia2006@gmail.com  Apoio financeiro: FAPESPA, CNPq e Embrapa.   Material e métodos  Foram selecionados cinco genótipos de O. mapora pertencentes ao Banco de Germoplasma do Complexo Oenocarpus/Jessenia da Embrapa Amazônia Oriental. Esses genótipos foram coletados em diferentes locais: Cruzeiro do Sul (AC), Sena Madureira (AC), Santo Antonio do Tauá (PA), Abaetetuba (PA) e Parintins (AM). De cada genótipo foi coletado uma amostra fresca (folíolo) de folha recém-aberta para a extração de DNA.  O DNA genômico total foi extraído pelo procedimento semelhante ao de Doyle & Doyle (1990). Posteriormente, foi diluído para a concentração de trabalho de 10 ng.µl-1. Nas cinco amostras foram testados 112 primers RAPD. As reações de PCR foram preparadas para volume final de 15 µl, contendo 35 ng de DNA genômico, 1mM de cada um dos desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1,3 mM de um oligonucleotídeo iniciador (primer), 10 mg.ml-1 de BSA (bovine serum albumin), 1 unidade da enzima Taq polimerase (InVitrogen, Brasil) e tampão de reação contendo MgCl2 fornecido pelo fabricante da enzima.   As reações foram preparadas em microtubo de 0,2 ml e amplificadas em termociclador Amplitherm TX96 programado para 40 ciclos, conforme Oliveira (2005) e em cada ciclo, a desnaturação do DNA ocorreu a 94ºC por 1 minuto, o anelamento ocorreu a 37ºC por 1 minuto e a elongação ocorreu a 72ºC por 2 minutos. Após os 40 ciclos, ocorreu a etapa de extensão final realizada a 72ºC por 7 minutos.   Os produtos da reação foram aplicados em gel de agarose Invitrogen na concentração de 1% e preparado com tampão TBE (0,45 M de Tris-Borato e 0,01 M de EDTA) 1,0X. Em seguida, os produtos foram separados por eletroforese, em cuba horizontal contendo TBE 1,0X, conduzida em voltagem constante de 100 V por 1 hora e 30 minutos.   Os géis foram visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e as imagens foram capturadas digitalmente.   Resultados e Discussão  Dos 106 primers testados, 8 não amplificaram e 10 tiveram amplificação fraca. Dos que amplificaram, apenas 19 foram monomórficos e, consequentemente, do total de primers avaliados 65,1% apresentaram polimorfismo. O número de bandas polimórficas detectadas nos primers variou de 1 a 10, com média de 3,17 bandas polimórficas por primer.  Levando em consideração somente os primers polimórficos, foram amplificadas 307 bandas, das quais 219 foram polimórficas, gerando 71,3% de polimorfismo. Com um número maior de genótipos, Loo et al. (1999) obtiveram 74% de polimorfismo em Licuala glabra, enquanto Oliveira (2005) obteve 100% de polimorfismo quando aplicou 28 primers RAPD previamente selecionados em 116 acessos de Euterpe oleracea. Como foram utilizados apenas cinco genótipos, é esperado que com o uso de mais genótipos e de diferentes locais, o polimorfismo e a média de bandas polimórficas por primer para O. mapora sejam bem maiores. Dos 69 primers que geraram bandas nítidas e polimórficas, 24 foram selecionados para serem aplicados nos demais acessos, com base na sua amplificação e número de bandas polimórficas (Tabela 1).  Estes primers geraram um total de 126 bandas polimórficas, com no mínimo 4 bandas e com média de 5,25 bandas por primer. Oliveira (2005) quando aplicou 120 primers RAPD em cinco genótipos de acaizeiro selecionou 28 deles que revelaram bandas nítidas e alto grau de polimorfismo.  Conclusão   Dos 106 primers RAPD testados, 24 podem ser aplicados nos acessos de bacaby para estudos genéticos.   Agradecimentos   Ao CNPq pela concessão de bolsa ao primeiro e quarto autores e a FAPESPA e EMBRAPA pelo financiamento do trabalho.    Referências  FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. 220 p.  DOYLE, J.J  & DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15, 1990.  LOO, A.H.B.; TAN, H.T.W.; KUMAR, P.P.;  SAW, L.G. Population analysis of Licuala glabra var. glabra (Palmae) using RAPD profiling. Annals of Botany, v.84, p. 421-437, 1999.  OLIVEIRA, M.S.P. Caracterização molecular e morfo-agronômica de germoplasma de açaizeiro. 2005, 171f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas)- Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2005.  WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, L.A.; TINGEY, S.V. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.   Tabela 1. Primers RAPD selecionados para a análise genética em acessos de Oenocarpus mapora.   Primers selecionados Seqüência Número de bandas Número de bandas polimórficas OPA-04 5’-AATCGGGCTG-3’ 8 4 OPA-06 5’-GGTCCCTGAC-3’ 6 5 OPA-12 5’-TCGGCGATAG-3’ 6 5 OPAB-11 5’-GTGCGCAATG-3’ 7 7 OPAB-12 5’-CCTGTACCGA-3’ 5 4 OPAB-01 5’-CCGTCGGTAG-3’ 6 4 OPAB-02 5’-GGAAACCCCT-3’ 5 4 OPAB-19 5’-ACACCGATGG-3’ 5 4 OPAR-07 5’-TCCTTCGGTG-3’ 6 6 OPAZ-04 5’-CCAGCCTCAG-3’ 6 6 OPAZ-11 5’-TCCAGCGCGT-3’ 4 4 OPB-11 5’-GTAGACCCGT-3’ 6 5 OPJ-12 5’-GTCCCGTGGT-3’ 11 10 OPM-07 5’-CCGTGACTCA-3’ 5 5 OPN-11 5’-TCGCCGCAAA-3’ 9 5 OPO-03 5’-CTGTTGCTAC-3’ 4 4 OPO-12 5’-CAGTGCTGTG-3’ 8 5 OPO-16 5’-TCGGCGGTTC-3’ 9 8 OPS-13 5’-GTCGTTCCTG-3’ 6 5 OPS-15 5’-CAGTTCACGG-3’ 6 6 OPU-01 5’-ACGGACGTCA-3’ 6 6 OPU-06 5’-ACCTTTGCGG-3’ 6 5 OPU-16 5’-CTGCGCTGGA-3’ 5 5 OPU-17 5’-ACCTGGGGAG-3’ 4 4 Total  149 126 Média geral  6,21 5,25                    Figura 1. Gel de agarose contendo exemplos de polimorfismo gerados por três primers RAPD nos cinco genótipos de O. mapora. 1, Parintins, AM; 2, Cruzeiro do Sul, AC; 3, Sena Madureira, AC; 4, Santo Antonio do Tauá, PA; 5, Abaetetuba, PA.    1       2       3      4     5      1     2      3      4     5      1     2     3      4     5                 OPL-07                        OPA-07                     OPA-09 

Seleção de primers RAPD para caracterização genética em Oenocarpus mapora.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal