O objetivo desse trabalho foi identificar grupos de genes envolvidos na resposta de bovinos à infestação artificial com o carrapato Rhipicephalus microplus, por meio da construção de redes gênicas. Dados de um experimento com microarranjos, provenientes da hibridização de amostras de pele de fêmeas cruzadas Senepol x Nelore, Angus x Nelore e Nelore, obtidas antes (A) e (D) após a infestação artificial com o carrapato, foram analisados por meio de uma metodologia de construção de redes baseada em co-expressão gênica (WGCNA). Os dados foram pré-processados usando os pacotes affy e gcrma do R/Bioconductor e as redes de co-expressão identificadas separadamente para cada grupo (A e D), pelo pacote R/WGCNA. As redes foram comparadas e os módulos não conservados entre os dois grupos foram identificados a partir de um teste de correlação dos valores de conectividade. Nossa análise identificou 8 módulos de genes co-expressos, sendo um deles (6) não conservado entre os grupos. O modulo 6 (n=85 genes) mostrou-se enriquecido para o processo biológico Proteólise, sugerindo o envolvimento desse processo e dos genes identificados (ADAMTS4, CASP4, C3, CFB, PRSS22 e SPCS3) na resposta dos animais à infestação

GIACHETTO, P. F.

IBELLI, A. M. G.

OKURA, V. K.

REGITANO, L. C. de A.

SALMAN, A. K.

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  48a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia   O Desenvolvimento da Produção Animal e a Responsabilidade Frente a Novos Desafios Belém – PA, 18 a 21 de Julho de 2011   _______________________________________________________________________________________________________________________________ Página 1 de 3   Identificação de mecanismos envolvidos na resposta de bovinos ao carrapato Rhipicephalus microplus1   Poliana Fernanda Giachetto2, Vagner Katsumi Okura3, Adriana Mércia Guaratini Ibelli4, Ana Karina Dias Salman5, Luciana Correia de Almeida Regitano6  1Parte de projeto financiado pela Embrapa e pelo CNPq (477705/2008-1)  2Pesquisadora da Embrapa Informática Agropecuária – CNPTIA, Campinas, SP. E-mail: poliana@cnptia.embrapa.br  3Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular – CBMEG/UNICAMP, Campinas, SP. Bolsista da Embrapa Informática Agropecuária. e-mail: vagnerko@cnptia.embrapa.br 4Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução – UFSCar, São Carlos, SP. e-mail: adriana.ibelli@gmail.com  5Pesquisadora da Embrapa Rondônia – CPAFRO, Porto Velho, RO. E-mail: aksalman@cpafro.embrapa.br  6Pesquisadora da Embrapa Pecuária Sudeste  – CPPSE, São Carlos, SP. E-mail: luciana@cppse.embrapa.br    Resumo: O objetivo desse trabalho foi identificar grupos de genes envolvidos na resposta de bovinos à infestação artificial com o carrapato Rhipicephalus microplus, por meio da construção de redes gênicas. Dados de um experimento com microarranjos, provenientes da hibridização de amostras de pele de fêmeas cruzadas Senepol x Nelore, Angus x Nelore e Nelore, obtidas antes (A) e (D) após a infestação artificial com o carrapato, foram analisados por meio de uma metodologia de construção de redes baseada em co-expressão gênica (WGCNA). Os dados foram pré-processados usando os pacotes affy e gcrma do R/Bioconductor e as redes de co-expressão identificadas separadamente para cada grupo (A e D), pelo pacote R/WGCNA. As redes foram comparadas e os módulos não conservados entre os dois grupos foram identificados a partir de um teste de correlação dos valores de conectividade.  Nossa análise identificou 8 módulos de genes co-expressos, sendo um deles (6) não conservado entre os grupos. O modulo 6 (n=85 genes) mostrou-se enriquecido para o processo biológico Proteólise, sugerindo o envolvimento desse processo e dos genes identificados (ADAMTS4, CASP4, C3, CFB, PRSS22 e SPCS3) na resposta dos animais à infestação.     Palavras–chave: expressão gênica, microarranjos, redes gênicas   Identification of mechanisms involved in cattle response to Rhipicephalus microplus tick  Abstract: The aim of this study was to identify groups of genes involved in cattle response to Rhipicephalus microplus tick, through gene network building. Microarray gene expression data from the hybridization of skin samples from bovine females Senepol x Nelore, Angus x Nelore and Nelore, obtained before (A) and after (D) artificial tick infestation, were analyzed using a network building methodology based on gene co-expression (WGCNA). Data were preprocessed using affy and gcrma R/Bioconductor packages and gene co-expression networks identified separately for each group (A and D), by the R/WGCNA package. Gene networks were compared between the two groups and non-conserved modules were uncovered from a correlation test of the connectivity values. Our analysis identified 8 modules of co-expressed genes, one of them (6) non-conserved between the groups. The module 6 (n=85 genes) was enriched for the biological process Proteolysis, suggesting the involvement of this process and identified genes (ADAMTS4, CASP4, C3, CFB, and PRSS22 SPCS3) on animal response to cattle-tick infestation.   Keywords: gene expression, gene network, microarray  Introdução Nos países tropicais, as perdas causadas pela infestação de bovinos pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus têm levado a um grande impacto nos sistemas de produção animal, em função da redução no ganho de peso e conversão alimentar, juntamente com as doenças transmitidas pelo parasita. De maneira geral, animais Bos taurus indicus são menos susceptíveis à infestação do que animais Bos   48a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia   O Desenvolvimento da Produção Animal e a Responsabilidade Frente a Novos Desafios Belém – PA, 18 a 21 de Julho de 2011   _______________________________________________________________________________________________________________________________ Página 2 de 3  taurus taurus, mas as bases moleculares que caracterizam essa diferença, assim como todos os mecanismos que permeiam a resposta à infestação, independente do genótipo, ainda não são completamente entendidos. O estudo da expressão gênica é uma abordagem que permite relacionar as diferenças nos níveis de expressão dos genes às diferenças fenotípicas observadas entre as amostras comparadas.  A tecnologia dos microarranjos, largamente utilizada nesses estudos, nos permite, além da tradicional identificação dos genes diferencialmente expressos entre amostras contrastantes, identificar grupos de genes altamente relacionados (co-expressos). Esse último enfoque pode contribuir de maneira mais efetiva para o entendimento de características fenotípicas complexas, as quais são poligênicas por natureza. A partir da identificação de genes co-expressos, redes gênicas são construídas e grupos de genes mais fortemente conectados, ou módulos, podem ser relacionados a vias específicas. Outra estratégia consiste em se descobrir diferenças na composição dos módulos e na conectividade dos genes entre diferentes conjuntos de dados, o que tem se mostrado bastante útil na descoberta de mecanismos moleculares alterados entre amostras fenotipicamente distintas (Fuller et at., 2007), e que poderá trazer informações importantes para a compreensão dos mecanismos moleculares que permeiam a resistência de bovinos ao carrapato. Assim, comparando dados de microarranjos de bovinos antes e após a infestação artificial com o carrapato, nós utilizamos uma análise baseada em co-expressão diferencial na busca por mecanismos envolvidos na resposta do animal ao R. microplus.      Material e Métodos Os dados de microarranjos utilizados na identificação das redes de co-expressão gênica foram gerados a partir do experimento descrito em Ibelli et al. (2010). Resumidamente, fêmeas bovinas cruzadas Senepol x Nelore (n=7), Angus x Nelore (n=7) e Nelore (n=7), livres de carrapato, foram submetidas a 4 infestações artificiais consecutivas, cada uma com cerca de 20.000 larvas de R. microplus. Amostras de pele foram coletadas antes (grupo A) da primeira e 24 horas após (grupo D) a última infestação, e usadas para extração de RNA total.  As amostras foram submetidas à análise de expressão gênica utilizando a plataforma de microarranjos GeneChip® Bovine Genome Array (Affymetrix). Os dados foram pré-processados usando os pacotes affy e gcrma do R/Bioconductor e um filtro foi aplicado, que resultou na utilização somente dos transcritos presentes em todas as amostras. As redes de co-expressão gênica foram identificadas separadamente para cada grupo (A e D), pelo pacote R/WGCNA (Zhang & Horvath, 2005). A metodologia WGCNA (Weighted Gene Co-expression Network Analysis) considera as redes de co-expressão como grafos ponderados, não direcionados. Dentro dos grafos os nós correspondem aos genes e as conexões entre os genes são determinadas pela correlação entre eles, obtida ao longo dos perfis de expressão das amostras.  A comparação entre as redes identificadas em A e D foi feita com base na correlação da conectividade (força de conexão) dos genes e da estrutura (genes componentes) dos módulos, de acordo com Fuller et al. (2007). Uma vez construídas as redes, os módulos foram submetidos à análise de enriquecimento funcional por meio da ferramenta DAVID (Huang e tal., 2009), que exibe os termos mais freqüentes presentes em uma lista de genes, baseado em ontologia gênica, possibilitando a identificação dos processos biológicos em evidência.  Resultados e Discussão De um total de 23.000 transcritos bovinos presentes no microarranjo, 3.467 atenderam aos critérios adotados na filtragem dos dados e foram utilizados na identificação das redes gênicas. Nossa análise identificou 8 módulos de genes co-expressos ao  longo das amostras A e D: 1 (n=66 genes), 2 (n=407 genes), 3 (n=163 genes), 4 (n=105 genes), 5 (n=42 genes), 6 (n=85 genes), 7 (n=1315 genes) e 8 (n=121 genes). A comparação da estrutura e conectividade dos módulos identificou o módulo 6 como não conservado entre A e D. Um fato interessante foi que 44% dos genes presentes nesse módulo foram diferencialmente expressos, segundo resultados de Ibelli et al. (2010), sendo o módulo com a maior porcentagem de genes diferencialmente expressos. A análise de enriquecimento funcional do módulo 6 (Tabela 1) identificou o processo biológico Proteólise como o mais representativo dos genes componentes do módulo, sugerindo que esse processo pode ter sido alterado por ocasião da infestação dos bovinos.     48a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia   O Desenvolvimento da Produção Animal e a Responsabilidade Frente a Novos Desafios Belém – PA, 18 a 21 de Julho de 2011   _______________________________________________________________________________________________________________________________ Página 3 de 3  Tabela 1 - Análise de enriquecimento funcional do módulo 6 (n=85 genes), baseada em termos de  ontologia gênica (GO) Categoria Termo Genes (no) Genes (%)d p value GOTERM_BP_ALLa Proteólise 6 14,29 1,3X10-2 GOTERM_CC_ALLb Região extracelular 8 19,05 2,2x10-3 GOTERM_MF_ALLc Atividade endopeptidase 4 9,52 4,1x10-2 Categorias de ontologia gênica representadas: aProcesso Biológico, bComponente celular, cFunção molecular. d % de genes presentes em relação ao total de genes utilizados na análise de enriquecimento funcional (n=42)   O processo de proteólise ocorre em vias metabólicas envolvidas em várias funções, incluindo mecanismos de defesa, por estarem associadas ao reconhecimento e apresentação de antígenos, ativação de plasminogênio e regulação do sistema complemento. Nosso trabalho evidenciou genes envolvidos nesse processo biológico como alterados em bovinos após a infestação com o carrapato. Em Ibelli et al. (2010), os genes em questão (ADAMTS4, CASP4, C3, CFB, PRSS22 e SPCS3) mostraram-se ativados em bovinos, em resposta a infestação pelo R. microplus. C3 e CFB já foram relacionados à ativação do sistema complemento, um dos mecanismos de defesa primários a infecções e injúrias, ativando a cascata do complemento, que pode culminar na não fixação e expulsão do carrapato no hospedeiro. SPCS3 e PRSS22 atuam na regulação da coagulação sanguínea, impedindo a alimentação e manutenção dos carrapatos, mecanismo esse que parece ser bastante importante na defesa do hospedeiro, uma vez que elícita no parasita a produção de inibidores de serino proteases (SERPINAS) na saliva, quando estão parasitando o bovino (Mulenga et al. 2009). Por outro lado, recentemente, Papareddy et al. (2010) descreveram pela primeira vez, in vitro, que a proteólise na cascata de coagulação sanguínea leva ao surgimento de peptídeos de defesa, envolvidos na resposta à invasão microbiana e à injúria.    Conclusões O processo de Proteólise e os genes ADAMTS4, CASP4, C3, CFB, PRSS22 e SPCS3 estão envolvidos na resposta de bovinos à infestação pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Trabalhos futuros, buscando o papel desses genes ou processo biológico em bovinos de diferentes grupos genéticos poderão trazer informações importantes acerca dos mecanismos moleculares que permeiam a resistência de bovinos ao parasita.       Literatura citada FULLER, T.F.; GHAZALPOUR, A.; ATHEN, J.E. et al. Weighted gene coexpression network analysis strategies applied to mouse weight. Mammalian Genome, v.18, p.463-472, 2007. HUANG, D.W.;  SHERMAN, B.T.; LEMPICKI, R.A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protocols, v.4, n.1, p.44-57, 2009. IBELLI, A.M.G.; CARDOSO, F.F.; GIACHETTO, P.F. et al. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE  PARASITOLOGIA VETERINÁRIA, XVI, 2010, Campo Grande. Anais... Goiânia: Sociedade Brasileira de Parasitologia, 2010. (CD-ROM).  MULENGA, A.; KHUMTHONG, R.; CHALAIRE, K.C. Ixodes scapularis tick serine protease inhibitor (serpin) gene family, annotation and transcriptional analysis. BMC Genomics, v.10, n.217, 2009. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2689274> Acesso em 20/04/2011. PAPAREDDY, P.; RYDENGARD, V.; PASUPULETI, M. et al. Proteolysis of human thrombin generates novel host defense peptides. PLoS Pathogens, v.6, n.4, 2010. Disponível em <http://www.plospathogens.org> Acesso em 19/04/2011.   ZHANG, B.; HORVATH, S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, v.4, n.1, p.1-37, 2005. 

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