A cultura do mamão (Carica papaya L.) no Brasil tem apresentado crescimento expressivo na região Nordeste, responsável por mais de 60% da produção nacional (IBGE, 2008). Certamente, os principais fatores que afetam a expansão da cultura são os problemas fitossanitários, principalmente as viroses. Dentre as espécies de vírus que infectam o mamoeiro no Brasil o vírus da meleira (Papaya meleira virus, PMeV), relatada na década de 80 afetando pomares no sul da Bahia (Nakagawa et al., 1987) e norte do Espírito Santo (Rodrigues et al., 1989), atualmente é a principal doença da cultura em todas as principais regiões produtoras do nordeste.pdf 151

ANDRADE, E. C. de

DALTRO, C. B.

SANTOS, A. F. dos

VELAME, K. V. C.

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Análise molecular de isolados do vírus da meleira do mamoeiro (Papaya meleira virus - PMeV).

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ANÁLISE MOLECULAR DE ISOLADOS DO VÍRUS DA MELEIRA DO MAMOEIRO(Papaya meleira virus - PMeV)Cleidiane Borges Daltro1;Adriana Fiuza dos Santos2;Karinna Vieira Chiacchio Velame3;Eduardo Chumbinho de Andrade41Estudante de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia;2Estudante de Agronomia da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia;3Bolsista ITEC -2 FAPESB4Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical; (eandrade@cnpmf.embrapa.br)IntroduçãoA cultura do mamão (Carica papaya L.) no Brasil tem apresentado crescimento expressivona região Nordeste, responsável por mais de 60% da produção nacional (IBGE, 2008).Certamente, os principais fatores que afetam a expansão da cultura são os problemasfitossanitários, principalmente as viroses. Dentre as espécies de vírus que infectam omamoeiro no Brasil o vírus da meleira (Papaya meleira virus, PMeV), relatada na década de80 afetando pomares no sul da Bahia (Nakagawa et al., 1987) e norte do Espírito Santo(Rodrigues et al., 1989), atualmente é a principal doença da cultura em todas as principaisregiões produtoras do nordeste.Os sintomas observados em plantas infectadas pelo vírus são caracterizados por umaexsudação espontânea do látex nos frutos, que posteriormente se oxida, dando um aspectoborrado ou 'melado' ao fruto, do qual deriva o nome da doença. O PMeV é um vírus departículas isométricas e genoma composto por RNA fita dupla (dsRNA) de aproximadamente12 Kb, características que fazem este um vírus ser distinto dos demais fitovírus descritos naliteratura (Maciel-Zambolim et al., 2003). Experimentos comprovaram a transmissão do víruspela espécie de mosca branca Bemisia tabaci, (Vidal et al., 2005) além de ser transmitidoatravés de ferimentos produzidos por instrumentos perfurantes contaminados.Apesar dos enormes prejuízos acarretados pelo PMeV na cultura do mamoeiro no Brasil,poucos trabalhos estão sendo dedicados ao estudo molecular deste patógeno. Diante distoo presente trabalho visou realizar estudos moleculares de isolados coletados nas  principaisregiões produtoras de mamão.MetodologiaAmostras de de látex de mamoeiros com sintomas de meleira foram coletadas nas regiõesprodutoras de mamão nos estados do Espírito Santo (ES), Bahia (BA) Pernambuco (PE),Rio Grande do Norte (RN) e Ceará (CE). As amostras de látex foram testadas utilizando ométodo descrito por Rodrigues et al. (2005). As amostras positivas foram selecionadas paraas análises moleculares, que consistiram na amplificação de uma região do genoma quecodifica parte da replicase viral (RNA polimerase dependente de RNA -RdRp), utilizando ooligonucleotídeo descrito por Teixeira et al., 2007.Para a síntese do cDNA foram adicionados em um microtubo 5µg de RNA total, 2pmoles dooligonucleotídeo reverso, 4µL do tampão da reação, 1µL de dNTPs a 10mM, 2µL de DTT0,1M e 200u da enzima transcriptase reversa (M-MLV, Invitrogen), e volume completadopara 20µL com água. Na reação de PCR foi utilizado 2,5µL do cDNA, 5µL do tampão daPCR, 3µL de MgCl2 25mM, 1µL dos dNTPs (2,5mM), 0,8pmol de cada oligonucleotídeo, 1Ude Taq DNA polimerase, e o volume completado para 50µL com água. Os produtos da PCRforam analisados por eletroforese em gel de agarose 1%.Os fragmentos amplificados foram clonados utilizando o Kit “pGEMT-easy” (Promega) einseridos em células competentes de E. coli DH5α pelo método do choque térmico. Aclonagem foi confirmada por meio de extração dos plasmídeos, clivagem com a enzima EcoRI e analise dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose 1%.As sequências obtidas foram comparadas com as presentes no banco de dados desequência - GeneBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), comparadas e alinhadasentre si utilizando-se o programa ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) para a obtenção dograu de variabilidade existente e as árvores filogenéticas foram construídas com o auxílio doprograma MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007).Resultados e DiscussãoAs coletas das amostras de látex em plantas com sintomas típicos de meleira foramrealizadas em diferentes propriedades em cada região. Devido a alta incidência, foramcoletadas diversas amostras em cada uma das propriedades visitadas, totalizando 188amostras. Todas as amostras foram avaliadas para a presença do vírus, que foi detectadoem 100% das amostras, e a partir então cada amostra considerada como  um isolado.Foram escolhidos isolados representativos de algumas regiões levantadas (Tabela 1) paraos trabalhos iniciais de análise molecular e estudos de variabilidade genética. Tabela 1: Localidades onde foram coletados os isolados.Isolado Local de coleta2 Eunápolis - BA23 Sooretama - ES27 Quixeré -CE36 Bebedouro - ES47 Miguel Calmon -BA157  Juazeiro -BAPMeV-Man Espírito SantoNo primeiro momento, de cada isolado foi amplificado e sequenciado um fragmento deaproximadamente 600pb, cujas sequências foram então comparadas as depositadas nobanco mundial de sequências (GeneBank). As análises das sequências de aminoácidosdeduzidas tiveram maior homologia com a proteína RdRp de espécies de vírus que tambémpossuem genoma composto de dsRNA como o PMeV, mas que infectam fungos, como oPhlebiopsis gigantea mycovirus - PGV, Diplodia scrobiculata virus e Fusarium graminearummycovirus-3, resultado que reforça a hipótese levantada por Maciel-Zambolin et al., (2003)que o PMeV é um fitovírus bem distinto de qualquer um até o momento já descrito, e podeindicar uma possível origem deste patógeno que até anos atrás não se associava a culturado mamão.Posteriormente foi realizada uma análise comparativa entre as sequências de nucleotídeosdos isolados, observando uma conservação relativamente alta, variando entre 72-99%(Tabela 2). Visando verificar se a conservação se mantinha na sequência da proteínascodificada, foram então comparadas as sequências parciais de aminoácidos deduzidos daproteína RdRp, verificando que o nível de conservação entre os isolados nesta região daproteínas se mantinha similar ao observado para nucleotídeo, variando entre 79 -99%(Tabela 2). O isolado 2 foi o teve a menor homologia em relação aos outros isolados, tanto anível de nucleotídeo quanto á aminoácidos, variando de 72-79 e 79 – 80%, respectivamente.Isolados 2 23 27 36 47 157 PMeV-Man PGV2 80 80 79 80 79 3823 77 97 89 97 89 3927 72 99 92 99 92 3136 79 89 88 91 94 3247 72 99 99 88 91 31157 74 74 84 85 84PMeV-Man 79 90 90 95 90 82 32PGV 28 30 20 30 36 34As sequências de aminoácidos da RdRp dos isolados foram alinhadas para possibilitar ageração de árvores filogenéticas. As árvores geradas com base nos alinhamentosapresentaram uma topologia similar para ambas proteínas, com os isolados se mantendonos mesmos ramos e formando os mesmos grupos, de forma que apenas a árvore geradacom a sequência da RdRp está representada na Figura 1.Figura 1. Árvore filogenética obtida a partir do alinhamento da sequência parcial denucleotídeos do gene RdRp dos isolados de Papaya lethal yellow virus (PLYV). Foi utilizadoo método “Neighbor-Joining” e bootstrap com 500 repetições. PGV, Phlebiopsis giganteamycovirus (GeneBank n°: CAJ34335.2)ConclusõesAs análises moleculares iniciais indicam que o PMeV é uma espécie de vírus distinto dos jádescritos na literatura, podendo ter sido originado de uma alteração em um vírus que infectafungo que então passou se replicar no mamoeiro. Além disso, a região genômica do vírusanalisada e bem conservada entre os isolados indicando que esta região do genoma viralcodifica parte importante da proteína RdRp, podendo ser útil no desenvolvimento deestratégias de resistência derivada do patógeno, como a geração de plantas transgênicas.ReferênciasARAÚJO, M.M.M; TAVARES, E.T., SILVA, F.R. MARINHO, V.L.A., SOUZA Jr, M.T. Moleculardetection of Papaya meleira virus in the latex of Carica papaya by RT-PCR. Journal ofVirological Methods 146:304-310, 2007.IBGE, 2010. http://www.sidra.ibge.gov.br. Acessado em 20/08/2010.MACIEL-ZAMBOLIM, E.; KUNIEDA-ALONSO, S.; MATSUOKA, K.; CARVALHO, M.G.;ZERBINI, F.M. Purification and some properties of Papaya maleira virus, a novel virusinfecting papayas in Brazil. Plant Pathology 52:389-394, 2003.NAKAGAWA, J., TAKAYAMA, Y. & SUZUKAMA, Y. Exudação de látex pelo mamoeiro.Estudo de Ocorrência em Teixeira de Freitas, BA. IN:Congresso Brasileiro de Fruticultura, 9,Campinas. Anais... Campinas, SP. 1987. pp. 555-559.RODRIGUES, C.H., ALVES, F.L., MARIN, S.L.D., MAFFIA, L.A, VENTURA, J.A. &GUTIERREZ, A.S.D. Meleira do mamoeiro no estado do Espírito Santo:enfoquefitopatológico. In:Selecta de Trabalhos sobre a Meleira do mamoeiro. Linhares, EMCAPA.1989.RODRIGUES, S.P., GALVÃO, O.P., ANDRADE, J.S., VENTURA, J.A., FERNANDES, P.M.B.Método molecular simplificado para o diagnóstico da meleira do mamoeiro em látex etecidos de plantas infectadas. Summa Phytopathologica, 31(3):273-275. 2005.VIDAL, C.A; NASCIMENTO,A.S. ; HABIBE,T.C. Transmissão do vírus da meleira domamoeiro (Carica papaya L.) por insetos. Magistra v.17, n.2, p.101-106,2005.

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