O abacaxi é uma das frutas tropicais mais apreciadas em todo mundo. O Brasil, como um dos centros de origem e diversidade genética da espécie, tem se destacado no melhoramento genético e na conservação de germoplasma desta importante fruteira (Cabral et al.,2004). Dentre as doenças de maior impacto na abacaxicultura brasileira destaca-se a fusariose, para a qual várias ações estão sendo desenvolvidas, incluindo o lançamento de híbridos resistentes. O programa de melhoramento da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical (CNPMF) já lançou os abacaxis Imperial, Vitória e Ajubá, com excelentes características organolépticas, alta produtividade e resistentes à fusariose (Cabral e Matos, 2005; Ventura et al., 2007; Cabral e Matos, 2008).pdf 70

ANDRADE, E. C. de

CARVALHO, H. L.

JUNGHANS, D. T.

SANTOS, K. C. dos

SOUZA, F. V. D.

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CULTIVO DE MERISTEMAS APICAIS DE PLANTAS IN VITRO PARA LIMPEZAVIRAL EM ABACAXIFernanda Vidigal Duarte Souza1; Eduardo Andrade Chumbinho1; Davi Theodoro Junghans1Elder Lima Carvalho2, Keila Cidreira dos Santos,31 Pesquisadores Doutores da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Caixa postal 007 –Cruz das Almas – BA; CEP: 44380-000; e-mail: fernanda@cnpmf.embrapa.br;eandrade@cnpmf.embrapa.br; davi@cnpmf.embrapa.br; 2 Assistente de Pesquisa daEmbrapa Mandioca e Fruticultura Tropical – e-mail: elder@cnpmf.embrapa.br;  3Estudantebiomedicina -FAMAM.INTRODUÇÃOO abacaxi é uma das frutas tropicais mais apreciadas em todo mundo. O Brasil,como um dos centros de origem e diversidade genética da espécie, tem se destacado nomelhoramento genético e na conservação de germoplasma desta importante fruteira (Cabralet al.,2004).Dentre as doenças de maior impacto na abacaxicultura brasileira destaca-se afusariose, para a qual várias ações estão sendo desenvolvidas, incluindo o lançamento dehíbridos resistentes. O programa de melhoramento da Embrapa Mandioca e FruticulturaTropical (CNPMF) já lançou os abacaxis Imperial, Vitória e Ajubá, com excelentescaracterísticas organolépticas, alta produtividade e resistentes à fusariose (Cabral e Matos,2005; Ventura et al., 2007; Cabral e Matos, 2008).Por outro lado, a murcha do abacaxizeiro, causada por um complexo viral (Pineapplemealybug wilt associated virus, PMWaV 1-3), transmitido pela cochonilha Dysmicoccusbrevipes (Sether et al., 2005), é uma doença que tem ocasionado grandes perdaseconômicas nas principais regiões produtoras do Brasil e do mundo Além dos danos diretos no vigor e produção da planta, os danos indiretos sãopreocupantes, pois em alguns casos as plantas contaminadas não apresentam sintomas,que só se manifestam quando a planta infectada pelo vírus também é colonizada pelacochonilha vetora (Sether et al., 2002), dificultando a seleção de mudas no campo para oplantio.  Outro agravante, são as mudas produzidas em biofábricas que não são certificadas,e por não apresentarem sintomas, poderão estar introduzindo o vírus em áreas produtorasainda indenes. O diagnóstico simultâneo deste complexo viral já foi desenvolvido noCNPMF, permitindo, dessa forma a indexação de materiais elite oriundos do programa demelhoramento genético (Andrade et al., 2010).Para instalação de novas áreas de plantio, tradicionalmente se utiliza de mudaspropagadas vegetativamente (filhotes ou rebentões), o que torna essa virose ainda maissignificativa. Um dos agravantes é a presença de algumas cepas do vírus, sem os sintomasreconhecidos, o que pode ampliar sua disseminação em grandes cultivos comerciais, ondeas mudas são originadas, prioritariamente de biofábricas e não são certificadas. Entretanto, uma vez identificada a presença do vírus é necessário odesenvolvimento de uma estratégia de remoção e limpeza, considerando principalmente aquestão do estabelecimento de matrizeiros para a produção de mudas certificadas.O cultivo de meristema e a termoterapia são estratégias usadas para limpeza devírus em diversas espécies. Em abacaxi, no entanto, ensaios realizados no Hawaii a partirdo cultivo in vitro e da termoterapia de gemas axilares, mostraram que o uso detemperaturas elevadas não foi eficiente e o cultivo de gemas axilares obteve um resultadodiscreto e diretamente ligado ao tamanho do explante utilizado (Sether et al., 2001).Em vista disso, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologiaque possa garantir a limpeza do vírus da murcha do abacaxizeiro a partir de meristemasapicais excisados de plantas in vitro, como uma nova estratégia a ser avaliada.MATERIAL E MÉTODOSComo material vegetal foram usadas plantas do híbrido Ajubá cultivadas em telado epreviamente indexadas, onde se comprovou a presença do vírus. O método de indexaçãoutilizado foi o desenvolvido por Andrade et al. (2010). As plantas com xxxx de idade foramidentificadas, com cada gema axilar identificada individualmente. As gemas a partir do terçosuperior do talo foram removidas, desinfestadas e introduzidas em tubos de ensaio,individualmente em meio de cultura MS sem qualquer regulador de crescimento (Souza etal., 2009). Numa primeira etapa do processo, as gemas foram introduzidas comaproximadamente 5 a 7 mm, com retirada  do máximo de tecido ao redor da mesma eincubadas em câmara de crescimento com temperatura de 27°C± 1; intensidade de fluxo defótons de 22 µEm-2s-1e fotoperíodo de 16 horas. Numa segunda etapa do processo, asplantas únicas oriundas destas gemas foram levadas para a cabine de fluxo laminar e, comauxílio de um microscópio estereoscópio, foi realizada a excisão do meristema apical comaproximadamente 1 mm, que foi em seguida cultivado em meio MS + 0,5 mg de BAP/L, 30 gde sacarose/L, e 2,0 g/l de Phytagel.. As condições de incubação foram as mesmas daetapa anterior. Após o desenvolvimento dos meristemas e obtenção de planta inteira, foirealizada nova indexação,pelo seguinte critério: foi utilizado como  controle, um lote deplantas oriundas da primeira etapa, ou seja, plantas que foram introduzidas (ou obtidas ?!) invitro, mas não passaram pela segunda etapa de retirada de meristema reduzido.RESULTADO E DISCUSSÃOAs gemas introduzidas na primeira etapa levaram aproximadamente 60 dias para sedesenvolver, o que inclui o intumescimento e o desenvolvimento da planta. Entretanto,  seoptou que a planta atingisse um maior tamanho, para permitir maior êxito na retirada domeristema apical, por ser um procedimento extremamente delicado, uma vez que se utilizouem uma planta monocotiledônea in vitro. Não existem, até o momento, registros desseprocedimento em plantas in vitro de abacaxi, até pela dificuldade que apresenta o uso deseu meristema apical em plantas in vivo.Extremamente aquoso e difícil de ser identificado, além da facilidade e bonsresultados obtidos com as gemas axilares de talos ou coroas, o uso de meristemas apicaisem abacaxi é pouco expressivo e praticamente não é usado, ainda que Albuquerque et al.(2000), tenham utilizado esse tipo de explante para limpar plantas infectadas por Fusariumsubglutinans f. sp. ananas, agente causal da fusariose.O desenvolvimento das plantas nesta segunda etapa foi extremamente lento, emdecorrência, principalmente, ao tamanho do meristema. Esse comportamento é tambémobservado em outras espécies cujo cultivo de meristema é usado para limpeza clonal eonde o tamanho do explante é decisivo para o êxito do trabalho. Em morango, ametodologia descrita por Biswas et al. (2007) relata que o meristema deve estar entre 0,3 e0,5 mm para que a remoção do virus seja obtida. Em mandioca, o meristema deve conter odomo meristemático acompanhado de dois primórdios foliares apenas, o que determina ummeristema em torno de 0,2 a 0,3 mm (Souza et al., 2009). Em banana, outramonocotiledônea, o tamanho adequado, está em torno de 1 mm.O resultado com as plantas da primeira etapa apenas, mostrou que a simplespassagem pela cultura de tecidos não foi suficiente para remover o vírus, como mostraramos resultados da posterior indexação. Do lote de seis plantas controle (plantas da primeiraetapa) 100% seguiam com a presença do vírus.Das plantas que foram cultivadas nas duas etapas, obteve-se  50% de recuperação,resultado considerado muito interessante, visto que não se utilizou nenhum tipo determoterapia ou estratégia acessória. Como uma planta adulta de abacaxi pode teraproximadamente 20 gemas possíveis de serem introduzidas in vitro, ao considerar osterços médio e superior, a recuperação de 10 plantas garante matrizes que podem serusadas para micropropagação de plantas efetivamente sadias.A passagem de uma planta pela cultura de tecidos pode melhorar muito seudesempenho no campo, com aumento da produtividade pela sanidade e padronização domaterial plantado. Entretanto, apenas esse procedimento não pode garantir a limpeza doclone, se este está infectado por vírus.Novos lotes de plantas estão sendo avaliados a fim de validar a metodologiaproposta.Figura 1: Indexação das mudas de abacaxi in vitro quanto ao PMWaV por RT-PCR. Foramtestados dois lotes de mudas, o primeiro  formado de mudas oriundas de gemas lateraisretiradas de plantas infectadas (linhas 1 a 6) e o segundo formado de mudas oriundas demeristemas apicais de aproximadamente 1mm excisados de mudas in vitro (linhas 7 -12). M,marcador de peso molecular 100pbREFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASAlbuquerque, C,C.; Camara, T.R.; Menezes, M.; Willadino, L,; Meunier, I.; Cláudia Ulisses,C. Cultivo in vitro de ápices caulinares de abacaxizeiro para limpeza clonal em relação àfusariose, Sciencia Agrícola, Piracicaba. V.57, n.2, p.363-366, 2000.Biswas, M.K.; Hossain, M.; Islam, H. Virus free plantlets production of strawberry throughmeristem culture. World Journal of Agricultural Sciences, n.3, v.6. p757-763, 2007.CABRAL, J. R. S.; FERREIRA, F. R.; MATOS, A. P.; SANCHES, N. F. Banco ativo degermoplasma de abacaxi da Embrapa Mandioca e Fruticultura. Cruz das Almas.Embrapa – CNPMF, 2004. 30p. (Documentos, 80).Cabral, J.R.S., Matos, A.P. BRS Ajubá, nova cultivar de abacaxi. Comunicado Técnico 126.Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. 4p. 2008.Cabral, J.R.S., Matos, A.P. Imperial, Nova Cultivar de Abacaxi. Comunicado Técnico 114.Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. 4p. 2005.Ventura, J.A., Costa, H., Cabral, J.R.S., Matos, A.P. ‘Vitória’: New Pineapple CultivarResistant to Fusariosis. Acta Horticulturae, 822:51-55. 2007.Sether, D.M., Karasev, A.V., Okumura, C., Arakawa, C., Zee, F., Kislan, M.M., Busto, J.L.and Hu, J.S. 2001. Differentiation, distribution, and elimination of two different Pineapplemealybug wilt-associated viruses found in pineapple. Plant Dis. 85:856-864.Sether, D. M.; Hu, J. S. Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for thedevelopment of mealybug wilt of pineapple disease. Phytopathology, St. Paul, v.92, n.9,p.928-935, 2002.Sether, D. M.; Melzer, M. J.; Busto, J.; Zee; F.; Hu, J. S. Diversity and mealybugtransmissibility of ampeloviruses in pineapple. Plant Disease, v. 89, p. 450-456, 2005

Cultivo de meristemas apicais de plantas in vitro para limpeza viral em abacaxi.

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