CARNEIRO, A. A.

CARNEIRO, N. P.

GOMES, E. A.

MARRIEL, I. E.

RESENDE, D. F.

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Variação da Comunidade Bacteriana na Rizosfera de Linhagensde SorgoSelecionados para Eficiência no Uso de NitrogênioPrevious  Top Next  ANDRÉA A. CARNEIRO, IVANILDO E. MARRIEL, DÉBORA F. RESENDE,ELIANE A. GOMES e NEWTON P. CARNEIRO    Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG – Caixa Postal 151 –andreac@cnpms.embrapa.br    INTRODUÇÃO  A rizosfera é a região do solo que é influenciada biológica e bioquimicamente pela raiz deuma planta. As alterações físico-químicas e biológicas que ocorrem neste ambientesustentam uma intensa atividade microbiana (Rosado et al., 1999). Microrganismospresentes na rizosfera disponibilizam nutrientes (fosfato inorgânico, nitrogênio),estimulam o crescimento de plantas (produção de reguladores de crescimento vegetal),controlam ou inibem a atividade de fitopatógenos e melhoram a estrutura do solo.Portanto, um maior entendimento das associações rizosféricas entre plantas emicrorganismos, pode auxiliar na redução substancial de agroquímicos que atualmentesão utilizados nas lavouras (Van Elsas et al., 1999).  Mais de 99% dos microrganismos vistos ao microscópio não são ainda cultivados emmeio de cultura. Entretanto, progressos têm sido feito no desenvolvimento de ferramentasmoleculares aplicadas aos estudos ecológicos de comunidades microbianas contornando anecessidade de se cultivar microrganismos para posterior identificação.  Atualmente, a estratégia molecular mais utilizada para análise de um ecossistemamicrobiano é a extração do DNA total do ambiente, seguido da amplificação do seuconjunto de genes SSU rDNA (small subunit ribossomal) utilizando oligonucleotídeosiniciadores específicos para o grupo de microrganismos que se tem interesse em analisar(Wieland et al., 2001). O gene rDNA possui regiões que são conservadas e outrasvariáveis dentro de uma mesma população, possibilitando o seu uso em estudos deecologia microbiana. O fracionamento dos fragmentos de rDNA amplificados da partir deDNA total de solo pode ser realizado pela técnica do DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis). Nesta técnica, fragmentos de DNA de um mesmo tamanho mas comdiferentes seqüências podem ser separados. A separação é baseada na variação damobilidade eletroforética das diferentes conformações estruturais da molécula de DNAem um gel de polIacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes (uréia eformamida). A separação das duplas fitas de DNA ocorre em regiões situadas ao longo damolécula, "melting domains", que possuem condições de desnaturação idênticas. Quandouma destas regiões se desnatura, ocorre mudanças na conformação da molécula de DNApassando de helicoidal para parcialmente desnaturada e, nessa situação, a migração no gelpraticamente para. Portanto, moléculas com diferentes seqüências nucleotídicas vão pararde migrar em diferentes posições no gel (Muyzer & Smalla, 1998).  A Embrapa Milho e Sorgo tem realizado pesquisas voltadas para o desenvolvimento degenótipos de sorgo tolerantes aos estresses minerais, e pouco se conhece sobre aestrutura da comunidade microbiana presente na rizosfera dessas plantas. Nesse trabalhoprocurou-se caracterizar a comunidade bacteriana presente na rizosfera de linhagens desorgo selecionadas para a eficiência de uso de nitrogênio, cultivados sob as mesmascondições de adubação nitrogenada. O objetivo do trabalho foi verificar se existemdiferenças qualitativas ou quantitativas com relação às bactérias associada às raízes dosdiferentes cultivares de sorgo estudados, que podem estar relacionadas com a eficiênciade uso de nitrogênio.   MATERIAL E MÉTODOS     Foram avaliadas amostras de solo da rizosfera de 11 linhagens de sorgo do Banco Ativode Germoplasma da Embrapa Milho e Sorgo previamente selecionadas para eficiência nouso de nitrogênio (kg grãos.kg-1 N aplicado) e de uma amostra de solo não rizosférico.Os diferentes genótipos foram cultivados em Latossolo Vermelho Distrófico, fasecerrado, com baixa disponibilidade de N, distribuídos em um delineamento experimentalde blocos casualizados, com três repetições. De acordo com a análise química do solo,efetuou-se uma adubação básica com P2O5, K2O, além de micronutrientes e 12 kg.ha-1 N,como sulfato de amônio, aplicada no plantio. Não se efetuou adubação nitrogenada emcobertura. No florescimento, seis plantas de cada parcela foram retiradas com o sistemaradicular inteiro. As mesmas foram transferidas para o laboratório, onde as raízes foramdestacadas e deixadas secar à temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, oexcesso de solo nas raízes foi dispensado e somente o solo bem aderido foi consideradocomo rizosférico. Amostras do solo compostas de seis sub-amostras retiradas nos espaçosentre as parcelas experimentais, nas três repetições foram consideradas solo nãorizosférico.  DNA total foi extraído de 500 mg de solo utilizando o Kit FastDNA Spin (Bio 101, VistaCA USA). Os DNAs de solo isolados foram inicialmente amplificados por PCR,utilizando-se primers universais para amplificação do rDNA bacteriano F530 (5'- TGACTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG - 3') e R1401 (5'- GCG TGT GTA CAAGAC CC - 3'). Cada 25 µL de reação continha tampão de PCR 1X, 2 mM de MgCl2, 100µM de cada dNTP, 0,2 µM de oligonucleotídeos iniciadores, 25 ng de DNA e 1 unidadede Taq DNA polimerase (Life Technologies - Brasil). As condições de amplificação destaregião foram 20"- 92oC, 30"- 50oC, 1'- 72oC durante 35 ciclos. Estes fragmentos geradosforam reamplificados utilizando os primers 968CG (5'- AAC GCG AAG AAC CTT AC -3') e R1401, de maneira similar a primeira, modificando apenas as condições deamplificação (1' – 94oC, 1' – 55oC, 2' – 72oC; 35 vezes). Todas as reações foramfinalizadas com uma extensão a 72ºC por 7 min. Os produtos da amplificação dosconjuntos F 968CG e R1401 foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamidautilizando a técnica do DGGE durante 16 horas, 70V à 60oC e corados com prata(Miethling et al., 2000).   RESULTADOS E DISCUSSÃO  A amplificação por PCR do rDNA das bactérias da rizosfera das linhagens de sorgoutilizando os pares de oligonucleotídeos iniciadores F530/R1401 e F968/R1401 resultouem fragmentos de 870 e 430 pares de bases, respectivamente (Figura 1A e 1B).  As bandas de rDNA amplificadas por PCR foram recuperadas de todas as amostras desolo rizosférico e do controle não rizosférico. Efeito do tipo de cultivar utilizado sobre acomunidade bacteriana presente foi claramente observado (Figura 2).  Os diferentes padrões de DGGE puderam, em parte, ser correlacionados com a eficiênciano uso de nitrogênio (kg grãos.kg-1 N aplicado). No solo não rizosférico um menornúmero de bactérias foi encontrado quando comparado com as demais amostrasutilizadas. Cultivares com uma produtividade média maior do que 500 kg grãos.kg-1 Naplicado (cultivares números 14 e 15), apresentaram uma rizosfera mais complexa do queos cultivares com produtividade média menor do que 100 kg grãos.kg-1 N aplicado(cultivar 13). Nos cultivares com produtividade entre 200 e 500 kg grãos.kg-1 N aplicado,observou-se maior variação no padrão de bandas do DGGE. Entretanto, todosapresentaram uma rizosfera mais complexa do que o cultivar com menor produtividade, aqual foi bastante similar ao solo não rizosférico. Assim pode-se hipotetizar a existência deassociações entre bactérias e raízes de plantas de sorgo, para um melhor aproveitamentode nitrogênio do solo e, consequentemente, maior produtividade. Estas linhagensapresentando rizosferas contrastantes serão utilizadas em estudos futuros para um melhorentendimento da relação planta versus bactéria e eficiência no uso de nitrogênio.   LITERATURA CITADA  MIETHLING R G, WIELAND H, BACKHAUS H, TEBBE CC. 2000. Variation ofmicrobial communities in response to crop species, soil origin and inoculation withSinorhizobium meliloti L 33. Microb. Ecol. 40:43-56.  MUYZER G, SMALLA K. 1998. Application of denaturinggradient gel electrophoresis(DGGE) and temperature gradient gel elctrophoesis (TGGE) in microbial ecology.Antonie van Leeuwenhek. 73: 127-141.  ROSADO A S, DUARTE G F, MENDONÇA-HAGLER L C. 1999. In: Soil fertility, soilbiology, and plant nutrition interrelationships. J O Siqueira, F M S Moreira, A S Lopes, LR G Guilherme, V Faquin, A E Furtini Neto, J G Carvalho (eds). Lavras. Minas Gerais.Brasil. pp. 429-448  VAN ELSAS J D, VAN OVERBEEK L S. WIELAND G, NEUMANN R, BACKHAUSH. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 5849-5854         

Variação da comunidade bacteriana na rizosfera de linhagens de sorgo selecionados para eficiência no uso de nitrogênio.

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Variação da comunidade bacteriana na rizosfera de linhagens de sorgo selecionados para eficiência no uso de nitrogênio.

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