BORGES, M. T.

CASELA, C. R.

CHAVES, Z. M.

FERREIRA, A. S.

MARRIEL, I. E.

MONTEIRO, G. G.

UTIDA, M. K.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Método de Isolamento e Cultivo do Gênero Claviceps, AgenteCausal daDoença -Açucarada de Sorgo e de Outras GramíneasPrevious  Top Next   IVANILDO E. MARRIEL1, MARCELA T. BORGES2, GISELE G. MONTEIRO2,MIRIAM K. UTIDA3, ZULEIDE M. CHAVES4, CARLOS R. CASELA1 eALEXANDRE S. FERREIRA1   1Embrapa Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, Sete Lagoas, MG; 2Izabela Hendrix, BeloHorizonte, MG; 3UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil; 4DFP/UFLA, CP 37, 37200-000,Lavras, MG; E-mail: imarriel@cnpms.embrap.br     INTRODUÇÃO  O sorgo é o quinto cereal mais importante no mundo, como alimento humano e animal.No Brasil, a cultura mostra grande potencial de produção em razão de sua amplaadaptabilidade a estresses abióticos, práticas agrícolas e maquinarias comuns a outrasculturas. Nos últimos anos, área plantada com sorgo tem apresentando acentuadocrescimento, atingindo uma produção de 2,0 milhões t na safra 2003/2004, e contribuindopara a sustentabilidade da oferta de grãos na cadeia do agronegócio, como ingrediente deração animal.  Entretanto, sob condições de clima favoráveis, a produção de sorgo pode ser afetada pelachamada doença-açucarada ou ergot, dentre outras. Essa doença foi constatada pelaprimeira vez no País, em 1995 (Ferreira & Casela, 1995). A forma anamórfica de seuagente etiológico foi classificado como Sphacelia sorghi e a forma teleomórfica comoClaviceps. Em 1996, a forma telemórfica foi reclassificada como Claviceps africana(Reis et al.,1996). O gênero Claviceps pertence à família Clavicipitaceae, triboClavicipeae. Pazoutová ( 2001) comenta a distribuição de 45 espécies de Claviceps aredor do mundo, as quais apresentam crescimento epifítico e endofítico. Esse autorsugere ainda que, com base em estudos filogenéticos e coevolutivos, esse gênero teveorigem na América do Sul. Os membros desse gênero são parasitas especializados degramíneas, que infectam especificamente as flores individuais da panícula, causando baixodesenvolvimento ou impedindo o desenvolvimento de grãos. Em vários casos, podeocorrer a perda completa da cultura. Portanto, quando se utilizam linhagens com macho-esterilidade citoplasmática susceptíveis como fêmeas parentais, a doença torna-se crucialna produção de sementes híbridas. Os resultados disponíveis indicam certo grau deespecificidade fungo-hospedeiro (Pazoutová et al., 2002; Pazoutová et al., 2004).  Pesquisas visando o seu controle com a aplicação de produtos químicos apresentaramresultados satisfatórios para o manejo da doença (Pinto et al., 2003). Não obstante essesucesso, as tentativas de obtenção de cultura pura do agente causal conforme preconizadona literatura, apresentava elevado grau de insucesso, principalmente, devido a ocorrênciasistemática de um fungo contaminante no exsudado, que possui uma fase leveduriforme,com uma colônia marrom-púrpura, além de outros fungos que geralmente colonizam agota. Estes fatos impediram a formação de um banco de isolados desse fungo pela equipede fitopatologia da Embrapa Milho e Sorgo e outras Instituições de Ensino e de Pesquisa.A existência de uma coleção ex-situ torna-se importante para o conhecimento dosaspectos ecológicos, epidemiológicos, bem como dos aspectos genéticos de fungos dogênero Claviceps no Brasil.   OBJETIVOS  Neste trabalho, procurou-se desenvolver uma metodologia que facilitasse o isolamento ecultivo de fungos do gênero Claviceps, visando o estabelecimento de uma coleção ex-situ fungos deste patógeno.   MATERIAL E MÉTODOS  Fontes de macroconídios:  Utilizaram-se gotas, em diferentes estágios de exsudação, coletadas em panículas desorgo e de capim colonião, crescidas em áreas experimentais da Embrapa milho e Sorgo,Sete Lagoas, MG. Na maioria dos casos, uma gota foi suspendida em 200 l de soluçãosalina, 0,85% e diluída. Uma alíquota de 0,1 ml dessa suspensão foi transferida eespalhada nas placas contendo os respectivos meios de cultura em teste.   Método clássico de isolamento:  Após o transferência do material da gota para placa, através de estrias sobre o meiosólido, efetuava-se o monitoramento diário da placa sob microscopia ou lupa, paravisualização e transferência de pedaços de ágar com conídios viáveis, e livres de levedura,para novo meio. Essas operações de subculturas eram repetidas quantas vezesnecessárias, até se obter o crescimento micelial e a colônia do fungo, o que pode ocorreem torno de duas semanas.   Diversidade metabólica da levedura  Na tentativa de limitar o crescimento do contaminante leveduriforme presente noexsudado da gota, avaliou-se sua capacidade metabólica, através do sistema Biolog, paraidentificar fontes de carbono não metabolizada por esse fungo. Alíquotas de 120  deuma suspensão de leveduras, contendo aproximadamente 106 UFC /ml, foram distribuídasem EcoMicroplate e incubadas durante 48 horas. Após esse período, foram identificadasas fontes não utilizadas por esse fungo.       Germinação de macroconídios de sorgo em meios de cultura  Seis meios de cultura (MC1, MC2 MC3 MC4 MC5 MC6), incluindo dois elaborados comas fontes de carbono selecionadas a partir da diversidade metabólica, tween 80 e D-málico, foram utilizados para avaliar a influência do meio de cultura sobre a germinação ecrescimento de Claviceps de sorgo, em detrimento do fungo leveduriforme.          Crescimento de leveduras na presença de diferentes antibióticos  Os antibióticos estreptomicina, ampicilina, clorafenicol, gentamicina e tetraciclina enistatina foram adicionados ao meio de cultura BDA e testados como inibidores docrescimento da fase leveduriforme do contaminante presente no exsudado da gota. Assuspensões dos antibióticos foram esterilizados por filtração e adicionadas ao meioautoclavados. Alíquotas de 0,1 ml de diluições seriadas decimais de uma suspensão delevedura foram transferidas e espalhadas nas placas. Após 48 horas, efetuou-se acontagem de colônias.   Crescimento micelial de Claviceps diferentes meios de cultura  Para otimizar o crescimento micelial de um isolado de Claviceps de sorgo, foram testados10 meios de cultura (MIC1, MIC2, MIC3, MIC4, MIC5, MIC6, MIC7, MIC8, MIC eMIC10). Discos de aproximadamente 4 mm foram transferidos para o centro das placascontendo cada meio, com três repetições. Após seis dias de crescimento , à temperaturaambiente, avaliou-se o diâmetro das colônias.   RESULTADOS E DISCUSSÃO   Os resultados obtidos nos ensaios preliminares, utilizando-se do método clássico, visandoo isolamento de Claviceps a partir de exsudados de panícula, ergot, em sorgo, utilizando-se os meios Kirkoff e BDA, mostraram crescimento microbiano nos dois meios testados.Especialmente no meio Kirkoff, observou-se a presença de um microrganismo, colôniamarrom-púrpura, produção de expolímero, tipo exsudação, porém diferente do que seobserva a partir do crescimento de algumas bactérias. E os exames, sob microscopiaóptica e de contraste de fase, mostraram que se tratava de um fungo com faseleveduriforme, provavelmente do gênero Aureobasidium (Figura 1). Na etapa inicial dotrabalho, a presença frequente desse contaminante gerou confusão, sendo confundidocom o agente causal da doença. Na verdade, este fungo difere totalmente de fungos dogênero Claviceps que apresentam colônias brancas (Figura 2).     Na tentativa de limitar o crescimento dessa fase leveduriforme, foi avaliada a suacapacidade metabólica, através de EcoMicroplate Biolog, para identificar fontes decarbono não metabolizada por esse fungo. Os resultados mostraram baixa utilização de 12das 32 fontes testadas, inclusive Tween 80 e D- málico. Numa etapa seguinte, foramobtidos resultados da influência de seis meios sobre a germinação de macroconídios desorgo e crescimento micelial, incluindo as duas fontes selecionadas, visando meios deculturas que favorecesse o crescimento de Claviceps em detrimento da levedura. Osresultados mostraram valores para germinação variando de 0 a 81%, e ausência deleveduras nos meios testados. Entretanto, as colônias de Claviceps também apresentaramdesenvolvimento micelial limitado em alguns dos meios testados, como no tween 80 e D-málico. Por outro lado, no meio BDA houve elevada germinação, 81%, mas tambémocorreu desenvolvimento de leveduras que impediram a obtenção de colônias puras deClaviceps.  A partir dessas observações, efetuaram-se testes com diferentes antibióticos e diferentesconcentrações, visando inibir o crescimento desses microrganismos contaminantes. Emcontraste aos demais antibióticos que apresentaram efeitos negligenciáveis, com ainclusão de gentamicina e tetraciclina, separadamente, observou-se uma reduçãoacentuada do número de colônias de leveduras nas placas. E quando se utilizou a misturados dois antibióticos, notou-se eficiência ainda maior no controle do crescimento dessecontaminante. Outro aspecto interessante que resultou do uso desses antibióticos foi aeliminação da necessidade da série de subculturas, que além de laboriosas, não raramente,propiciam a contaminação das placas. Nesse caso, necessita-se de apenas umatransferência de colônias para novo meio, após 4 a 8 dias, dependendo da espécie dopatógeno. Os isolados de colonião apresentam maior taxa de crescimento, em relação aode sorgo. Vale salientar que a inclusão desses antibióticos e a determinação de suasrespectivas concentrações a serem adicionadas ao meio de cultura constituiu na etapachave para o sucesso dos isolamentos efetuados, a posteriori. Ao contrário da estratégiainicial, a viabilidade dessa nova metodologia tem sido validada em um estudo, emandamento, visando conhecer a distribuição ecológica, características moleculares eafiliação taxonômicas de isolados de diferentes espécies de gramíneas.  Em relação ao crescimento micelial de Claviceps de sorgo, os resultados da comparaçãode 10 meios, visando otimizar sua taxa de crescimento, estão apresentados na Figura 3.     Observaram-se diferenças significativas para crescimento micelial entre os diferentesmeios avaliados, com maior expansão das colônias após seis dias de crescimento, nosmeios MIC 7 e MIC 10 (BDA enriquecido, com antibióticos) e menor taxa decrescimento nos meios MIC 1, 2, 3, e 4. Resultados similares foram observados quandoforam comparados quatro meios para o acúmulo de massa micelial em meio líquido, coma inclusão de fonte nitrogênio, 1g/l de NH4Cl. O meio MIC 10 apresentou maior massamicelial.    CONCLUSÃO  O plaqueamento de uma suspensão diluída do exsudado de ergot meio de culturaproposto (MIC), BDA enriquecido, contendo os antibióticos gentamicina e tetraciclina,possibilita o isolamento de Claviceps, independente da etapa de subculturas, com altaprobabilidade de sucesso, bem como a obtenção de culturas puras em menor período detempo, em comparação com a estratégia anteriormente utilizada.   LITERATURA CITADA  FERREIRA, A. S. & CASELA, C. R., 1995. Ocorrência de Claviceps sorghi, agentecausal da doença ergot no Brasil. Fitopatologia Brasileira 20(Supl.): 302.  PAZOUTOVÁ, S. 2001. The phylogeny and evolution of the genus Claviceps.Mycologycal Research 105(3): 275-283.  PAZOUTOVÁ, S. Heteropogon triticeus, a New Host of Calviceps sorghi in India. 2001.J. Phytopathology, 150:1-4.2002  PAZOUTOVÁ, S. Pleomorphic conidiotion in Claviceps. Mycological Research108:126-135. 2004.  PINTO, N. F. J. Controle químico da ergot (Claviceps africana Frederckson Mantle & deMilliano) ou doença-açucarada e das principais doenças foliares do sorgo (Sorghumbicolor (L.) Moench) Ciênc. Agrotec., 27(4):936-944. 2003.  REIS, E. M., MANTLE, P.G. & HASSAN, H.A.G., 1996. First report in the Americas ofsorghum ergot disease, caused by a pathogen diagnosed as Claviceps africana. PlantDisease 80(4): 463. (abstract).        

Método de isolamento e cultivo do gênero Claviceps, agente causal da doença-açucarada de sorgo e de outras gramíneas.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488122/1/Metodoisolamento.pdf

Método de isolamento e cultivo do gênero Claviceps, agente causal da doença-açucarada de sorgo e de outras gramíneas.

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