CARNEIRO, N. P.

GOMES, E. A.

GUIMARAES, C. T.

JARDIM, S. N.

LANA, U. G. P.

PAIVA, E.

PURCINO, A. A. C.

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Genes Expressos nas Raízes de Duas Linhagens de MilhoTolerantes Sob Estresse de AlumínioPrevious  Top NextSÍLVIA N. JARDIM, ELIANE A. GOMES, UBIRACI G. P. LANA, EDILSON PAIVA,CLAUDIA T. GUIMARÃES, ANTÔNIO A. C. PURCINO e NEWTON P. CARNEIRO  Embrapa Milho e Sorgo, C. P. 151, 35701-970, Sete Lagoas, MG.  E-mail: newtonc@cnpms.embrapa.br   Palavras-chave: alumínio, estresse, EST, milho   INTRODUÇÃO  A maior parte do alumínio (Al) existente se encontra na forma de óxidos ealuminosilicatos, sendo ambas prejudiciais para as plantas (Ma & Furukawa, 2003). Nossolos ácidos, que compreendem 58% da terra arável no mundo, o Al é solubilizado e seencontra na forma de um cátion trivalente, Al3+. Em concentrações micromolares, o Al3+inibe o crescimento das raízes, com efeitos subseqüentes na absorção de água enutrientes, reduzindo a produtividade das culturas (Kochian, 1995). Apesar da toxidezcausada pelo Al ser um dos principais fatores limitantes da produtividade agrícola emsolos ácidos, os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares da tolerância a esseestresse não são completamente compreendidos (Delhaize & Ryan, 1995). Existe umagrande variação na tolerância das plantas ao Al sugerindo que as espécies e cultivarespossuem mecanismos diferentes para a detoxificação do Al. No caso do milho, estudosgenéticos indicam que poucos genes parecem estar envolvidos na tolerância ao Al.Cultivares geneticamente adaptados a solos ácidos podem oferecer uma soluçãoambiental compatível, contribuindo para um sistema agrícola sustentável. Esta abordagemé particularmente interessante para o milho, em que há germoplasma tolerante ao Aldisponível para seleção e estudos genéticos (Magnavaca et al., 1987). Devido à grandedisponibilidade de informações no GenBank, uma estratégia que pode ajudar a conhecermelhor os mecanismos moleculares inerentes à tolerância a esse estresse é oseqüenciamento sistemático de genes expressos em raiz de genótipos tolerantes napresença do estresse. Com essa estratégia pode-se determinar um perfil qualitativo equantitativo dos genes expressos e com isso inferir sobre níveis de proteínas relacionadosou não com o estresse de Al. O objetivo deste trabalho foi a identificação de genesexpressos em ápices radiculares submetidos à toxidez de Al, em dois genótipos de milhotolerantes, categorizando-os em termos funcionais com base nas informações disponíveisno GenBank.   MATERIAL E MÉTODOS  Sementes de milho das linhagens tolerantes ao estresse de Al, L3 e Cateto, foramgerminadas por três dias, no escuro, em papel toalha umedecido e transferidas parasolução nutritiva completa, pH 4.2, sem Al (Magnavaca, 1982). Após 15 dias de cultivo,as plantas foram expostas à mesma solução nutritiva contendo 222 M de Al na forma deKAl(SO4)2.12H2O por 4 horas e, em seguida, as raízes foram lavadas em água destilada,levemente secas com papel toalha, coletadas em N2 líquido e imediatamente usadas paraextração de RNA. Os RNAs foram isolados de pontas de raízes de 0,5 cm decomprimento, utilizando o método do trizol (Sambrook et al., 1989) e os RNAsmensageiros (mRNA) foram purificados em coluna de oligo dT (Invitrogen). Asbibliotecas de cDNA foram preparadas a partir de uma mistura de mRNA das duaslinhagens utilizando o kit "Smart cDNA Library Construction" (Invitrogen). A viabilidadedas bibliotecas de cDNA foi baseada no número de fagos por micrograma de cDNA, naporcentagem de recombinantes (IPTG/X-Gal), na digestão dos plasmídeos paraconfirmação da presença do inserto e na redundância de clones determinada por meio doseqüenciamento de aproximadamente 200 clones. Os clones da biblioteca de cDNA foramestocados em placas de 96 poços, em glicerol 10%, a -80C. As preparações de DNAforam feitas pelo método de lise alcalina (Sambrook et al. 1989) e o DNA obtido foiquantificado por eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio. Oseqüenciamento das extremidades 5' dos insertos foi realizado com o kit "BigDyeTerminator Cycle Sequencing" (Applied Biosystems) no seqüenciador capilar DNAABI3100 (Applied Biosystems). As seqüências de DNA foram analisadas pelo programaBlastN (Altschul et al., 1997) e comparadas com o GenBank Nucleotide Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).   RESULTADOS E DISCUSSÃO  A integridade do mRNA foi confirmada em gel de agarose, utilizando-se as bandas 18S e28S de RNA ribossômico como padrões (Figura 1). A biblioteca de cDNAs, cujo títulofinal foi de 106 fagos/mL, foi confeccionada com 1 g de mRNA. Para determinar onúmero de fagos recombinantes foi utilizada E. coli BM25.8 que contém um sistema deconversão de um clone TriplEX2 em um plasmídio pTriplEX2 por uma excisão ecircularização de um plasmídio completo a partir do fago recombinante. Foram obtidos,aproximadamente, 75% de clones recombinantes, cujos insertos variaram de 0,5 a 1,6 kb.    O seqüenciamento da extremidade 5' gerou seqüências com tamanho de 350 pares debases em média, representando as regiões mais conservadas dos genes. Foramseqüenciados 2.250 clones. A região 3' não foi seqüenciada devido à presença da caudapoli-A que dificulta o processo de seqüenciamento. As seqüências obtidas foramcomparadas no GenBank usando o programa BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast),considerando como limite o e-value igual ou menor a e-10. Dentre os clones seqüenciados,56% apresentaram similaridade com seqüências de milho, 21% de arroz e 11% deArabidopsis thaliana, sendo que 431 clones (19,3%) não apresentaram similaridade comnenhuma seqüência depositada no GenBank (Figura 2 ).     0  FIGURA 3. Categorização funcional dos clones de ESTs de milho expressos sob estressede alumínio.   CONCLUSÃO  O seqüenciamento de genes expressos em raízes de milho sob estresse de Al indicou quemecanismos de proteção ao estresse oxidativo, síntese de ácidos orgânicos, além de genesenvolvidos na síntese da parede celular e na organização do citoesqueleto, podem estarenvolvidos na tolerância ao Al. Vários genes induzidos sob outros tipos de estressesabióticos foram também identificados no presente estudo. No entanto, análises maisavançadas referentes à expressão gênica dos referidos clones são necessárias para aelucidação dos reais mecanismos envolvidos na tolerância ao Al em milho.   LITERATURA CITADA  DELHAIZE, E.; RYAN, P. Aluminum toxicity and tolerance in plants. Plant Physiology,v.107, p.115-121, 1995.  KOCHIAN, L.V. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants.Annual Review of Plant Physiology, v.46, p.237-260, 1995.  MA, J.F.; FURUKAWA, J. Recent progress in the research of external al detoxification inhigher plants: a Minireview. Journal of Inorganic Biochemistry, v.97, p.46-51, 2003.  MAGNAVACA, R. Genetic variability and the inheritance of aluminum tolerance inmaize (Zea mays, L.). Lincoln: University of Nebraska, 135p. Tese Doutorado, 1982.  PELLET, D.M.; GRUNES, D.L.; KOCHIAN, L.V. Organic acid exudation as analuminum-tolerance mechanism in maize (Zea mays L.). Planta, v.196. p.788-795, 1995. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning. A laboratorymanual. 2.ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.    

Genes expressos nas raízes de duas linhagens de milho tolerantes sob estresse de alumínio.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488076/1/Genesexpressos.pdf

Genes expressos nas raízes de duas linhagens de milho tolerantes sob estresse de alumínio.

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