RODRIGUES, J. A. S.

SCHAFFERT, R. E.

SOUZA, I. R. P. de

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Coloração Diferencial de Floroglucinol-HCL em HíbridosIsogênicos de Sorgo normal e BMR6Previous  Top Next Isabel R. P. de Souza1, José A. S. Rodrigues1e Robert E. Schaffter1   1Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, Sete Lagoas, MG, 35701-970. E-mail:avelino@cnpms.embrapa.br   Palavras-chave: lignina, brown midrib, anatomia.   Introdução  Estratégias genética e química têm sido utilizadas para melhorar a digestibilidade de fibrasde forragem (Campbell e Sederoff, 1996). Dentre estas, mutantes naturais forrageirosBrown midrib (bmr) têm apresentado considerável interesse agronômico, nos últimos 30anos, uma vez que reduz o conteúdo de lignina e consequentemente melhora adigestibilidade (Cherney et al., 1991). Estes mutantes, em sorgo, são fenotipicamentecaracterizados pela presença de uma pigmentação amarronzada na nervura central dasfolhas e esclerênquima do colmo. Embora a relação entre lignina e digestibilidade deforragem seja conhecida há muito tempo, isto não está totalmente entendido. É provávelque ambos, conteúdo total de lignina e composição do monômero de lignina tenhamimportância. Lignina é um polímero aromático, o qual em gramínea é composto pormonolignóis para-coumaril, coniferil e sinapil álcoois. O conteúdo dos ácidoshidroxicinâmicos, especialmente p-coumárico e ferúlico, tem sido inversamentecorrelacionado com a digestibilidade da parede celular, e apresenta-se alterado em algunsmutantes bmr (Kuc e Nelson, 1964; Kuc et al, 1968). Este trabalho teve como objetivoverificar a utilização do corante floroglucinol-HCl, o qual tem sido utilizadotradicionalmente para detectar cinamil aldeídos e lignina (Wardrop, 1971), nadiscriminação de genótipos de sorgo forrageiro utilizados para corte e pastejo, comfenótipos normais e bmr6.   Material e Métodos  Híbridos  O gene Brown midrib (bmr 6) foi introduzido nas linhagens-elites parentais de sorgo(BR007A, TX2784R, TX2785R, TX635A) utilizando-se técnicas de cruzamentospadrões de retrocruzamento e conduzidas pelo método genealógico tradicional, dentrodas atividades do programa de melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo. Estas linhagensforam utilizadas para produzir híbridos simples isogênicos para o gene Bmr6empregando-se técnicas de cruzamentos padrões.  Coleta de tecido vegetal  Foram utilizados três híbridos isogênicos, versões normal e bmr6: BR007A x TX2785R,TX635A x TX2785R e BR007A x TX2784R. Para as análises de coloração, foi coletadade diversas plantas, a terceira folha abaixo da folha bandeira e o terço médio inferior docolmo, aos 40 dias após plantio.  Coloração com Floroglucinol-HCL  As espécimes foram obtidas através de cortes manuais realizados com bisturi na partemediana da terceira folha e do colmo. Solução aquosa saturada de floroglucinol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi misturada, imediatamente antes da coloração, comsolução de HCl 20% na proporção de 1:1. As espécimes foram colocadas sobre lâmina demicroscópio e coradas com a solução de floroglucinol-HCl pelo período necessário paradistinção dos híbridos isogênicos normal e bmr6.  Microscopia ótica  Foto-documentação das espécimes foi obtida por meio de microscópio estereoscópioStemi SV6 Zeiss com máquina fotográfica acoplada.   Resultados e Discussão  Seções transversais do colmo de plantas de sorgo normal e bmr6 foram inicialmentecomparadas sem coloração e pode-se verificar no fenótipo do mutante a presença dacoloração amarronzada (Figura 1). Estas seções foram então coradas com solução defloroglucinol-HCL, reagente usado para detectar cinamil aldeídos e lignina (Wardrop,1971). Enquanto a anatomia dos tecidos mostra claramente que não houve alteração embmr, podem ser vistas diferenças no padrão de coloração. No colmo da versão normaldos híbridos, pouca coloração com floroglucinol-HCl foi evidente (Figuras 2 e 3),entretanto nos colmos contendo o gene bmr6, forte coloração ocorreu nos vasos doxilema, na bainha vascular e no parênquima subepidermal. Coloração também foiverificada nos mesmos tecidos da nervura central em bmr6 (Figuras 4, 5 e 6), entretanto,as células do parênquima e do parênquima subepidermal apresentavam coloração maisintensa do que as do colmo. Tanto para a nervura foliar, quanto para o colmo, a soluçãofloroglucinol-HCL permitiu distinguir através da coloração as versões normal e bmr6 apartir de 2 min, sendo que com 6 min a coloração era bem mais intensa. Pillonell et al.(1991) e Halpin et al. (1998) verificaram também em sorgo bmr6 e em milho bmr1,respectivamente, um aumento semelhante na coloração por floroglucinol. Este aumentotem sido verificado em mutantes bmr que apresentam redução na atividade da cinamilalcool desidrogenase (CAD), a qual afeta a composição do polímero de lignina, comsubsequente aumento na coloração devido provavelmente a uma incorporação de cinamilaldeídos, substratos para CAD (Clifford, 1974). Embora o floroglucinol reaja de certaforma com vários fenólicos, esta coloração intensa com os aldeídos, tem sido propostacomo específica (Provan et al., 1997). Conclui-se, deste trabalho, que os híbridos simplesisogênicos de sorgo, versões normal e bmr6 apresentaram coloração diferencial com asolução de floroglucinol-HCL, no colmo e na nervura central.   Agradecimentos  Ao laboratorista Célio Ramos das Neves pela valiosa contribuição na obtenção dos cortesde colmo e nervura.   Literatura Citada  Campbell, M.M. & Sederoff, R.R. Variation in lignin content and composition:mechanisms of control and implications for the genetic improvement of plants. PlantPhysiol 110: 3-13, 1996   Cherney, J.H.; Cherney, D.J.R.; Akin, D.E & Axtell, J.D. Potential of brown-midrib low-lignin mutants for improving forage quality. Adv. Agron. 46:157-198, 1991.   Clifford, M.N. Specificity os acidic phloroglucinol reagents. J. Chomatogr., 94: 321-324,1974.  Halpin, C.; Knight, M.E.; Foxon, G.A.; Campbell, M. M.; Boudet, A. M.; Boon, J. J.;Chabbert, B.; Tollier, M. T. & Schuch, W. Manipulation of lignin quality bydownregulation of cinnayl alcohol dehydrogenase. Plant J., 6: 339-350., 1994.   Kuc, J. & Nelson, O. E. The abnormal lignins produced by the brown-midrib mutants ofmaize. I. The brown-midrib-1 mutant. Arch. Biochem. Biophys., 105: 103-113, 1964.   Kuc, J., N; Nelson, O. E. & Flanagan, P. Degradation of abnormal lignins in the brown  midrib mutants and double mutants of maize. Phytochemistry, 7: 1435-1436, 1968   Pillonel, C.; Mulder, M. M.; Boon, J.J.; Foster, B. & Binder, A. Involvement of cinnamyl-alcohol dehydrogenase in the control of lignin formation in Sorghum bicolor L. Moench.Planta, 185, 538-544, 1991.   Provan, G.J.; Scobbie, L. & Chesson, A. Characterisation of lignin from CAD and OMTdeficient mutants of maize. J. Sci. Food Agric., 73: 133-142, 1997.   Van Soest, P. J. Nutritional Ecology of the Ruminant. End ed. Cornell University Press,Ithaca, NY, 1994.   Wardrob, A. B. Occurrence and formation in plants. In Lignins: Occurrence, Formation Structure andReactions (Sarkanen, K. V. & Ludwig, C. H., eds) New York: Wiley-Interscience, pp. 19-41, 1971.                             

Coloração diferencial de floroglucinol-HCL em híbridos isogênicos de sorgo normal e BMR6.

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Coloração diferencial de floroglucinol-HCL em híbridos isogênicos de sorgo normal e BMR6.

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