GUIMARAES, C. T.

LOPES, M. M.

PADILHA, L.

VIEIRA, M. G. G. C.

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Análises de Microssatélites em Bulk e Perfis Genéticos paraHíbridos de MilhoPrevious  Top Next   Lilian Padilha1, Magnólia M. Lopes2, Maria G.G.C. Vieira3 e Claudia T. Guimarães1    1Embrapa Milho e Sorgo, C.P. 151, 35701-970, Sete Lagoas, MG. 2UNESP, Jaboticabal, SP,14884-900. 3UFLA, C.P. 37, 37200-000, Lavras, MG. e-mail: lilian@cnpms.embrapa.br     Introdução  As sementes híbridas de milho, obtidas a partir de cruzamentos entre linhagens, têm comofonte de contaminação genética a auto-fecundação do parental fêmea nos campos deprodução de sementes. A técnica de microssatélites é eficiente para a detecção deste tipode contaminação em sementes (Salgado, 2001; Padilha et al., 2003), sendo umaferramenta importante para o monitoramento dos cruzamentos que ocorrem no campo.Os microssatélites ou SSR (Seqüências Simples Repetidas) são segmentos de seqüênciarepetida, distribuídos aleatoriamente no genoma, que são amplificados utilizando-se paresde primers específicos. A rapidez associada à precisão da análise são grandes vantagensda técnica de SSR. A possibilidade de análise de vários indivíduos de uma só vez, ou seja,a análise em bulk das amostras recebidas do campo, é mais uma vantagem que pode serassociada a este tipo de marcador. No entanto, faltam informações consistentes a respeitoda sensibilidade da técnica com relação ao número de indivíduos que podem ser utilizadosna montagem do bulk.  O objetivo do presente trabalho foi avaliar a sensibilidade da técnica de SSR quanto àeficiência de amplificação de dois alelos numa mesma amostra, presentes em diferentesproporções. Ainda, selecionar cinco conjuntos de primers eficientes em amplificar perfisgenéticos para distinguir cinco materiais híbridos dos seus parentais.   Material e Métodos  O trabalho foi conduzido no laboratório de Análise de Sementes e no Núcleo de BiologiaAplicada (NBA) da Embrapa Milho e Sorgo, em Sete Lagoas, MG. Foram utilizadassementes de quatro híbridos simples (HS1, HS2, HS3 e HS4), um híbrido triplo (HT) enove linhagens (L1, L2, ..., L9), provenientes do programa de melhoramento da EmbrapaMilho e Sorgo (Tabela 1).       A sensibilidade dos marcadores SSR foi avaliada pela capacidade de detecção do alelo emuma mistura de um híbrido (HS3) com uma linhagem não envolvida neste híbrido (L1).As misturas iniciais dos DNAs foram nas proporções de 1:0, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20,1:30 e 1:40, realizadas para o HS3 com a L1 e, de maneira inversa, para a L1 com o HS3.Os métodos para obtenção das proporções acima citadas foram: 1) mistura de volumes deDNA cuja concentração foi determinada em gel de agarose 0,8% e, 2) mistura de discosfoliares com diâmetro de 0,8 cm. Posteriormente, trabalhou-se com os valores de 1:5 e1:8 de misturas entre os DNAs das linhagens que participam dos híbridos.  O DNA foi extraído da parte aérea de plântulas com cinco dias de germinação em rolo depapel mantido a 25oC. Para representar cada genótipo, o DNA foi extraído de umconjunto de 10 plântulas. A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 0,8%,por meio da comparação com um DNA de concentração conhecida.  Para avaliar a sensibilidade da técnica de SSR, foram selecionados primers polimórficosque apresentavam boa qualidade de amplificação. Um total de 24 primers foi selecionadoa partir da avaliação de 100 primers. Foi simulada uma contaminação genética nasproporções de 1:1, 1:5, 1:8, 5:1, 8:1 de ambas as linhagens, para verificar a viabilidade deidentificação destes níveis de contaminação.  As reações de SSR foram realizadas segundo descrito em Padilha (2002). Os fragmentosamplificados foram separados em géis de agarose 4% e visualizados sob luz ultravioletaapós a coloração com brometo de etídio (1 mg/mL).   Resultados e Discussão  As misturas de volumes de DNA apresentaram o mesmo padrão de amplificaçãoobservado para as misturas de discos foliares. As proporções das misturas de 1:10 até1:40, independente do primer, não permitiram visualizar a presença do alelo da mistura.Assim foram realizadas avaliações com as proporções 1:5 e 1:8 das linhagens parentaisdos híbridos 1 a 4.  Na Figura 1 estão mostrados os géis com os produtos amplificados para dois híbridos.Verifica-se que a sensibilidade é variável com o primer utilizado. Isto pode estarocorrendo em função da maior ou menor especificidade do mesmo com relação ao seuanelamento na região a ser amplificada. Por outro lado, o contaminante presente nareação, também interfere na maior ou menor sensibilidade da técnica. A competição queocorre entre seqüências amplificadas simultaneamente, é uma provável explicação paraeste fato. Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), a reação de amplificação seráfavorecida onde a complementaridade entre o primer e o sítio de iniciação no DNA-molde é mais alta. Para o híbrido HS1, o primer bnlg125 não foi capaz de amplificar oalelo da linhagem L9 quando o DNA da L8 estava em concentrações 5 ou 8 vezessuperior. Quando o inverso ocorre, mesmo a L9 tendo o DNA 8 vezes mais concentradoque o DNA da L8, ainda é possível verificar um padrão correspondente à contaminaçãoda L9 com a L8.  Já o contrário ocorre para o primer bnlg166, que parece ser mais específico para a L9,cuja maior concentração de DNA na mistura com a L8 favorece a amplificação do aleloda L9. Por outro lado, o primer bnlg2291 não apresentou especificidade diferenciada paranenhuma das duas linhagens, sendo que um bulk de até 5 plantas pode ser recomendadopara este último caso. O comportamento diferenciado para a amplificação dos alelos doHS1 também foi verificado para o HS2 (Figura 1) e para os demais materiais genéticos.  Assim, para se trabalhar com bulks de plantas no monitoramento de contaminações emcampos de produção de sementes, é necessário que seja conhecida a sensibilidade datécnica para os locos a serem avaliados. Isto possibilitará a definição do número deplantas a ser utilizado para a construção do bulk. Para os primers aqui selecionados, umbulk de cinco plantas pode ser utilizado para o monitoramento da pureza genética emcampos de multiplicação de sementes de milho. A Tabela 2 apresenta a relação de primersque foram eficientes em distinguir o híbrido das suas linhagens parentais, para cada híbridosimples e triplo.          Literatura Citada  FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadoresmoleculares em análises genéticas. 3. ed. Brasília, DF: Embrapa-CENARGEM, 1998.220 p.   PADILHA, l. marcadores moleculares semi-automatizados na caracterização edeterminação da diversidade genética entre linhagens de milho tropical. 2002. 85p.Tese (Doutorado em Agronomia) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.   Padilha, L., Vieira, M.G.G.C., Guimarães, C.T. et al. Marcadores microssatélites paraavaliação de sementes genéticas de milho. Informativo Abrates, Londrina, v.13. n.3, p.82, 2003. Trabalho apresentado no XIII Congresso Brasileiro de Sementes, Gramado,RS. 2003.   Salgado, K.C.C. Certificação da pureza genética em sementes híbridas de milho pormeio de marcadores morfológicos e moleculares. 2001. 67p. Dissertação (Mestrado emFitotecnia) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.      

Análises de microssatélites em bulk e perfis genéticos para híbridos de milho.

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