BOMFETI, C. A.

CASELA, C. R.

FERREIRA, A. S.

MARRIEL, I. E.

MASSOLA JUNIOR, N.

MEIRELLES, W. F.

MESQUITA, S. F. P.

PACCOLA-MEIRELLES, L.D.

SOUZA-PACCOLA, E.A.

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CONFIRMAÇÃO DA ETIOLOGIA DA DOENÇA DESCRITA NO BRASILCOMO SENDO A MANCHA FOLIAR DE PHAEOSPHAERIA EM MILHOPrevious  Top Next Paccola-Meirelles LD1; Bomfeti, CA1; Souza-Paccola, EA1; Marriel, IE2; Mesquita, SFP1Massola Jr., N3, Casela, CR2; Meirelles, WF2; Ferreira, AS2    1Universidade Estadual de Londrina, CP 6001; CEP 86051 990/Londrina/PR.paccola@uel.br  2Embrapa Milho e Sorgo, CP 151 – Sete Lagoas/ MG, casela@cnpms.embrapa.br  3ESALQ/USP Piracicaba/SP   INTRODUÇÃO  A doença de milho (Zea mays), conhecida como mancha de phaeosphaeria (Figura 1A)vem sendo observada com alta intensidade em lavouras de milho no Brasil desde o iníciodos anos 80. Os sintomas iniciam-se pelo aparecimento, nas folhas, de manchas levementecloróticas, aquosas do tipo anasarca que tornam-se, posteriormente, necróticas decoloração palha. As lesões podem ser circulares a elípticas com 0,3 a 1 cm de diâmetro(Fernandes & Oliveira, 1997; Paccola-Meirelles et al., 1998), podendo coalescer etornarem-se irregulares. A expressão da doença é variável dependendo do genótipo daplanta (Paccola-Meirelles et al., 2002). Desde que a doença se estabeleceu em nosso País,poucos avanços foram conseguidos na tentativa de esclarecer a sua etiologia. Inicialmentea doença foi descrita como sendo a mancha foliar de Phaeosphaeria (Fantim, 1994)causada pelo ascomiceto Phaeosphaeria maydis, f. imperf. Phyllosticta sp. (Rane et al.,1966), porém vários autores relatam a dificuldade no isolamento deste fungo a partir daslesões (Cervelatti et al., 2002, Paccola-Meirelles et al. 1999, Amaral et al., 2002). Emtrabalho recente, Paccola-Meirelles et al. (2001), isolaram uma bactéria de coloraçãoamarela, identificada como Pantoea ananas (syn. Erwinia ananas), a partir de lesõesjovens. Esta bactéria quando inoculada em plantas de milho sob condições controladasreproduziu sintomas semelhantes aos do campo. No entanto ainda há controvérsias noque se refere ao agente causal. Amaral et al. (2002) sugeriram a existência de diferentesespécies fúngicas provocando sintomas da doença que, de acordo com o local de cultivo,uma ou outra espécie poderia ser o agente responsável. Em função destas discordânciasvárias técnicas foram aplicadas com o objetivo de definir o real agente causal destaimportante doença.   MATERIAL E MÉTODOS   Frequência de isolamento do agente etiológico: Lesões foram coletadas de diferentesregiões produtoras de milho no Norte do Paraná e Minas Gerais a fim de avaliar afrequência de isolamento dos fungos e da bactéria. Lesões do tipo anasarca foramdesinfectadas em Cloramina T 2%; parte da lesão foi colocada em meio para crescimentode fungos (BDA acrescido de solução de estreptomicina) e parte em meio para cultivo debactérias (TSA acrescido de ciclohexamida). Os isolamentos foram realizados nas safrasde 2002, 2003 e 2004.  Inoculação em casa de vegetação: O agente obtido em maior frequência durante oprocesso de isolamento foi inoculado em plantas de milho de 30 dias de idade do cultivarHS 200. O experimento foi conduzido em casa de vegetação sob condições controladas,conforme descrito por Paccola - Meirelles et al. (2001).  Análises através da Microscopia de Luz e Microscopia eletrônica de transmissão (MET):Lesões do tipo anasarca, obtidas a campo, foram coletadas, desinfectadas, fixadas emBouin, desidratadas, diafanizadas em série de etanol-xilol, incluídas em paraplast ecoradas pela técnica de Gram para tecidos. Lesões de campo e obtidas no processo deinoculação artificial com a bactéria foram processadas para visualização na MET. Estasforam desinfectadas, fixadas, desidratadas, emblocadas em Spurr e seccionadas emultramicrótomo. As secções foram observadas em microscópio Zeiss EM 900.  Teste de ELISA indireto: Anti-soro policlonal, produzido em coelho contra célulasbacterianas isoladas de lesões do tipo anasarca, foi utilizado para a identificação dabactéria em suspensão de tecidos lesionado, através do teste ELISA indireto. Aspreparações antigênicas foram obtidas a partir de segmentos foliares contendo lesõesanasarcas (0,1g) e segmentos destituídos de lesão (0,1 g - controle), os quais foramdesinfectados e macerados em 1,5 mL de tampão PBS (acrescido de 2% Polivinilpyrrolidona, 0,2% skim milk e 0,05% tween 20). A ocorrência de possíveis reaçõescruzadas, também foi verificada. As preparações antigênicas foram aplicadas emmicroplacas de poliestireno de 96 well em tampão PBS e incubadas overnight a 4o C.Após lavagem das canaletas com PBS -Tween 0,05%, foi acrescentado PBS-Caseína parabloqueio dos sítios livres. Adicionou-se o anti-soro (1: 400). As canaletas foram lavadasantes da adição da fosfatase alcalina conjugada (fosfatase-anti IgG). O - NitrophenylPhosphato foi usado como substrato. A conversão do substrato foi quantificada pelamedida de absorbância em 450 nm.  Extração de DNA diretamente das lesões e Reações de PCR: Folhas contendo lesõesforam coletadas e lavadas com sabão neutro. Cerca de 1 g de lesões do tipo anasarca e 1g de lesões necrosadas foram recortadas e maceradas em nitrogênio líquido. DNA totalfoi extraído segundo a técnica descrita por Doyle & Doyle (1987). Os fragmentos deDNA foram amplificados utilizando-se os seguintes oligonucleotídeos: ITS4 (InternalTranscribed Spacer do rDNA -universal para fungos), e seqüências do gene codificando o16S rRNA (16S DNAr) e do gene codificando a subunidade  da RNA polimerase (rpoB)(específicos para bactérias). Cada 25 µL de reação continha tampão de PCR 1X, 2 mMde MgCl2, 100 µM de cada dNTP, 0,2 µM de oligonucleotídeos iniciadores, 25 ng deDNA e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Life Technologies - Brasil). As condições deamplificação da região ITS de 645 pb utilizando ITS 4 foram 1'- 94oC, 1'- 50oC, 90"-72oC durante 40 ciclos. Todas as reações foram finalizadas com uma extensão a 72ºC por7 min. Um controle negativo foi feito para cada oligonucleotídeo iniciador, onde o DNAda reação foi substituído por água. Os géis foram corados com brometo de etídeo (0.5g/ml), visualizados sob luz ultravioleta e as imagens capturadas e estocadas em umsistema de fotodocumentação (Eagle Eye II, Stratagene).   RESULTADOS E DISCUSSÃO:   Em 40%das lesões, foi isolada uma bactéria de colônia lisa, com pigmentação amarelabrilhante (Figura 1B), semelhante àquela descrita por Paccola-Meirelles et al. (2001). Osfungos isolados no meio BDA mostraram uma diversidade inconstante, sempredominância de uma só espécie. A dificuldade do isolamento do fungo foi previamentedocumentada por outros autores (Cervelatti et al., 2002; Amaral et al., 2002).Inoculações em casa de vegetação, sob condições controladas, foram conduzidas com oisolado bacteriano e reproduziram sintomas da doença (Figura 2). As folhasdesenvolveram lesões cloróticas de coloração verde escura, típicas do estágio inicial dadoença, passando a necróticas posteriormente, confirmando os resultados obtidosanteriormente. Não foi observado sintomas nas plantas controle. Análises através daMicroscopia de luz e MET permitiram evidenciar a presença de um grande número debactérias no interior de lesões do tipo anasarca (Figura 3). A MET revelou, no espaçointercelular, a presença de bactérias em forma de bastonetes com 0.25 a 0.5 m de largurae 1.0 a 3.0 m de comprimento, tanto em lesões coletadas a campo como naquelasobtidas por inoculação artificial. Foi evidenciada também uma grande desorganização dotecido foliar na área das lesões. Bactérias não foram observadas nos exemplaresassintomáticos. Apenas nas lesões em estágios avançados de necrose foi possível observara presença de hifas e de estruturas reprodutivas fúngicas. Os testes de ELISA indiretopermitiram confirmar a presença da bactéria nas lesões, pois os valores de A450 foramconsistentemente maiores nas amostras contendo as anasarcas. Os resultados do PCRcom sequências específicas para fungos e bactérias no DNA extraído diretamente daslesões são apresentados na Figura 4. Amplificação foi obtida apenas com as sequênciasDNAr 16S e rpo . Não foi observado amplificação no oligonucleotídeo ITS4, universalpara fungo, o que indica ausência do fungo no interior das lesões avaliadas. Lesõesnecrosadas não apresentaram amplificação em nenhuma das sequências avaliadas,sugerindo uma diminuição da população bacteriana neste estágio.  Os resultados aqui apresentados comprovam aqueles obtidos anteriormente por Paccola -Meirelles et al. (2001) que indicam a bactéria como o agente etiológico da doença. Osfungos instalar-se-iam posteriormente em lesões pré-estabelecidas pela bactéria. Combase nos dados apresentados neste e em trabalhos anteriores, consideramos que a doençavem sendo erroneamente denominada de Mancha foliar de Phaeosphaeria e sugerimos ouso do termo Pinta branca em substituição a este, como já utilizado por alguns autores.   LITERATURA CITADA  Amaral, A L; Soglio, FK; Wernz Neto, AW; Pegoraro, DG; Vaccaro,E; Fantim,GM;Barbosa Neto, JF. Determinação de Agentes Causais de Manchas semelhantes à ManchaFoliar de Phaeosphaeria em Milho (Zea mays ) XXIV Congresso Brasileiro de Milho eSorgo., 2002.  Cervelatti EP, Paiva E, Meirelles, WF, Casela CR, Fernandes FT, Teixeira FF, Paccola-Meirelles. Characterization of fungal isolates from picnidia and pseudothecia from lesionsof Phaeosphaeria leaf spot in maize. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Ed. ABMS:Sete Lagoas, MG., v.1, n.3, p.30-37, 2002.  Doyle JJ, Doyle, JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, p.13-15.1987 Fantim GM. Mancha de Phaeosphaeria, doença do milho que vem aumentando suaimportância. Biológico, v.56, p. 39, 1994.  Fernandes FT, Oliveira E,. Principais Doenças na Cultura do Milho. Sete Lagoas,MG.Brasil : Embrapa-Circular Técnica, 26. 80p. 1997.  Paccola-Meirelles LD, Casela CR, Ferreira AS, Marriel IE, Meirelles WF, Detection of abacterium associated with a leaf spot disease of maize in Brazil. Fitopatologia Brasileira,v. 24, p.314-315, 1999.  Paccola-Meirelles LD, Casela CR, Parentoni SN, Meirelles WF, Ferreira AS, Marriel IE.Reação de linhagens de milho (Zea mays) a uma bactéria isolada de lesões da mancha dephaeosphaeria.In: XXII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2000, Uberlândia., 2000. Paccola-Meirelles, LD; Ferreira, AS; Meirelles, WF; Marriel, IE; Casela, CR. Detectionof a bacterium associated with a leaf spot disease of maize in Brazil. Journal ofPhytopatology, v. 149, p. 275-279, 2001.  Paccola-Meirelles LD; Meirelles, WF; Cervelatti, EP; Maki, CS; Casela, CR; Fernandes,FT; Ferreira, AS. Caracterização morfológica das lesões da mancha foliar porPhaeosphaeria em     híbridos de milho e avaliação da incidência do estágio sexuado e assexuado do patógeno.XXII Congresso Nacional de Milho e Sorgo,1998.  Paccola-Meirelles LD, Meirelles WF, Parentoni SN, Marriel IE, Ferreira AS, Casela CR.Reaction of maize inbred lines to a bacterium, Pantoea ananas, isolated fromPhaeosphaeria leaf spot lesions. Plant Breeding and Applied Biotechnology, v. 2, p. 587-590, 2002.  Rane MS, Payak MM, Renfro BL. A Phaeosphaeria leaf spot of maize In: Proceedings ofthe Symposia on Diseases of Rice Maize Sorghum and Millets 1966 New Delhi India: TheIndian Phytopathological Society, p. 8-10, 1966.         Figura 3: Observações na Microscopia de Luz (A-B) e MET (C-D): A) Folhas destituídas de lesões(controle); B) Lesão do tipo anasarca, mostrando bactérias em seu interior (seta). C) Lesão anasarca coletada acampo, mostrando bactérias no espaço intercelular (setas). D) Lesão anasarca obtidas de plantas inoculadasartificialmente em casa de vegetação, mostrando bactérias no espaço intercelular (seta).        

Confirmação da etiologia da doença descrita na Brasil como sendo a mancha foliar de Phaeosphaeria em milho.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488097/1/Confirmacaoetiologia.pdf

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