ALVES, V. M. C.

BRANDAO, R. L.

CARNEIRO, A. A.

CARNEIRO, N. P.

COSTA, G. T.

GONCALVES, M. A. C.

SCHAFFERT, R. E.

UTIDA, R. H.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Análise do Promotor do Gene Transportador de Fosfato debArabidopsis thaliana,AtPT2, em Plantas de Milho TransgênicasPrevious  Top Next  1GRACIELLE T. COSTA, 2ROSÂNGELA L. BRANDÃO, 2MARIANA C. A.GONÇALVES, 2RUTH H. UTIDA, 2ROBERT E. SCHAFFER, 2VERA M. C. ALVES,2NEWTON P. CARNEIRO e 2ANDRÉA A. CARNEIRO   (1)Depto Ciências Biológicas, PUC-MG; (2) Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG– Caixa Postal 151; andreac@cnpms.embrapa.br    Palavras-chave: promotor, transgênicos, estresse abiótico, milho, gene repórter   INTRODUÇÃO  No Brasil, solos ácidos são freqüentes na região que compreende o Cerrado, área quecobre uma extensão de 204 milhões de ha, dos quais 127 milhões são aptos à agricultura.O Cerrado responde por 25% da safra brasileira de milho, soja e arroz, entre outros grãoscultivados em uma área de 10 milhões de ha. A baixa fertilidade dos solos é um dosmaiores problemas para o desenvolvimento agrícola e produção de alimentos, nos solosácidos do Cerrado. A toxidez de alumínio e a deficiência de fósforo são os grandesfatores que limitam a produtividade agrícola nestas áreas.  O fósforo inorgânico (Pi) é um dos nutrientes menos disponíveis nos solos ácidos,encontrado frequentemente em concentrações similares à dos micronutrientes. Muitos dosconstituintes dos solos ácidos, principalmente os óxidos de ferro e alumínio, têm grandeafinidade pelo Pi. Na sua forma complexada, Pi não é liberado no solo e se encontraindisponível para a planta. Além de complexar com o Pi, o alumínio presente nestes tiposde solo é tóxico para as extremidades das raízes, inibindo o crescimento radicular(Kochian, 1995; Delhaize and Ryan, 1995).  A produção de variedades de plantas mais adaptadas a estes tipos de solos, obtidas pormelhoramento clássico ou engenharia genética, parece ser a melhor solução para resolveros problemas de fertilidade do Cerrado. Em diferentes espécies de plantas (trigo, milho,centeio, feijão, etc) tem sido mostrado que a tolerância ao alumínio ocorre por exclusãomediada pela liberação de ácidos orgânicos, tais como citrato, malato ou oxaloacetato, napresença de alumínio. No processo de exclusão, o ácido orgânico quela o Al+3 presentena rizosfera e previne sua entrada no ápice da raíz (Bhatti, et al. 1998). Ácidos orgânicostambém participam de reações químicas de trocas, onde o Al e/ou Fe complexados comPi do solo são deslocados e passam a formar complexos estáveis com os ácidos orgânicos, ficando o Pi disponível para as plantas (Fox, et al. 1990).  O enorme progresso alcançado pela biologia molecular e celular nos últimos anospermitiu o isolamento e caracterização de genes que codificam para ácidos orgânicos,transportadores de fosfato, fosfatases e promotores específicos para diferentes tecidosque podem ser utilizados para gerar cultivares transgênicos mais tolerantes ao alumíniopresente no solo do cerrado, bem como mais eficientes na absorção do fósforo (Fuente etal., 1997; Muchhal et al., 1996). Muchhal et al., 1996 mostraram que o promotor do genetransportador de fosfato AtPT2, isolado de A. thaliana, é capaz de direcionar a expressãode genes repórteres em raízes de tabaco sob deficiência de Pi. Este promotor poderia serutilizado para direcionar a expressão de genes como o da citrato sintase e transportadoresde Pi nas raízes de diferentes plantas, e assim reduzir o custo em carbono de plantascrescendo sob estresse. Neste estudo, foi analisada a capacidade do promotor AtPT2,isolado de A. thaliana, de direcionar a expressão do gene repórter GUS, em plantastransgênicas de milho, sob o estresse de Pi.   MATERIAL E MÉTODOS  Uma seqüência de 2300 bp da região 5' não-codante do promotor do gene AtPT2 foiisolada através de amplificação por PCR e, subclonada na frente da região codante dogene repórter GUS (-glucuronidase) (Figura 01).  Na produção de milho transgênico via biobalística, embriões imaturos, 1,0 - 1,5 mm,foram isolados em condições estéreis e cultivados durante 28 dias em meio CI (Chu et al.,1975) e bombardeados de acordo com Carneiro et al., 2000. A seleção de plantastransgênicas foi iniciada 15 dias após bombardeamento quando os calos de milho foramtransferidos para meio SM (meio CI sem prolina) suplementado com glufosinato deamônia. Calos foram subcultivados a cada 2 semanas em dosagens crescentes deglufosinato de amônia (3 e 9 mg/l). Plantas com aproximadamente 5 cm de altura,capazes de crescer em presença do agente seletivo, foram transferidas para solo em casade vegetação.  DNA genômico foi isolado de 38 plantas transformadas usando o protocolo de Dellaportaet al. (1983). A presença da construção gênica AtPT2.GUS nas plantas regeneradas foiconfirmada utilizando os primers A6 e A7 (CCA GTG TCT CCG TTC ACC TT e AACGGA TCC TCT TCT CCT CTG CAA), os quais amplificam uma região de 588 pb dopromotor. Cada 25 µl de reação continha tampão de PCR 1X, 2 mM de MgCl2, 100 µMde cada dNTP, 0,2 µM de cada um dos primers A6 e A7, 25 ng de DNA e 1 unidade deTaq DNA polimerase. As reações foram feitas utilizando um termociclador modelo 9600(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) programado para uma desnaturação inicial de 15segundos a 94oC, seguido de 30 ciclos de amplificação (15"- 94oC, 15"- 55oC, 30''- 72oC),e uma extensão final a 72ºC por 7 min.  Para avaliar a expressão da enzima -glucuronidase (gene repórter GUS), controlada pelopromotor AtPT2, foram realizados testes histoquímicos, de acordo com a metodologiadescrita por Rech e Aragão (1996). Para esses testes, 4 repetições de sementesprovenientes de 10 eventos transgênicos distintos foram utilizadas. As sementes foramdesinfestada superficialmente em 50% água sanitária comercial durante 10 minutos sobagitação. Após esta etapa elas foram enxaguadas em água destilada 3 vezes e colocadaspara germinar em papel Germitest, por 4 dias em água. Em seguida, as plântulas foramtransferidas para solução nutritiva completa (Magnavaca, 1982) por mais 4 dias e, depoisdeste período, 4 plantas de cada evento e o controle não transgenico foram transferidaspara solução nutritiva sem fósforo. As 4 plantas restantes foram mantidas em soluçãonutritiva completa. Após 5 dias nos diferentes tratamentos as plantas foram colhidas paraanálise da expressão de GUS.   RESULTADOS E DISCUSSÃO  Foram obtidas através bombardeamento de partículas, cultura de tecido e seleção, 38plantas de milho transgênicas, sendo 10 eventos diferentes, com a construção AtPT2-GUS. Estes eventos foram crescidos em casa de vegetação e submetidos a testesmoleculares para confirmação da transgenia (Figura 02).  O gene AtPT2 codifica para uma proteína de membrana transportadora de fosfato emArabidopsis thaliana (Muchhal et al., 1996). Com o objetivo de estudar o funcionamentodo promotor AtPT2, isolado de Arabidopsis thaliana, no sistema heterólogo do milho,2300 bp da região 5' não-codante do gene AtPT2 foi subclonada na frente da regiãocodante do gene repórter GUS (-glucuronidase). De acordo com os dados apresentadospor Karthiketyan et al.(2002), a expressão do repórter gene GUS foi detectada apenasnos tratamentos onde as plantas de milho foram submetidas ao estresse de fósforo,sugerindo que plantas compartilham mecanismos regulatórios comuns para a ativação degenes envolvidos na resposta a este tipo de estresse. Entretando, em oposição aosresultados obtidos com plantas transgênicas de A. thaliana e tabaco transformadas comesta mesma construção (Karthiketyan et al., 2002), a expressão do gene repórter GUS,neste experimento, não foi restrita às raízes. Na Figura 4, observa-se a presença da -glucuronidase em raízes e no sistema vascular de folhas de milho.  Os resultados sugerem que os mecanismos de regulação do gene AtPT2 isolado de A.thaliana, possuem semelhanças com os mecanismos de regulação de genes envolvidoscom o estresse de fósforo em milho. Entretanto, as regiões relacionados com odirecionamento da expressão preferencialmente, do gene AtPT2, em raízes dedicotiledôneas parecem não serem conservados para o milho, uma monocotiledonea.   LITERATURA CITADA  BHATTI JS, COMERFORD NB, JOHNSTON CT. Influence of oxalate and soil organicmatter on sorption and desorption of phosphate onto a spodic horizon. Soil Sci.Soc.Am.J.62:1089-1095.Soil Sci.Soc.Am.J. 62:152-158.1998.  CARNEIRO A. A., CARNEIRO N.P., CARVALHO C.H.S., VASCONCELOS M.J.V.,LOPES M.A., PAIVA E. Milho Transgênico : Melhoria da Qualidade Nutricional doGrão. Bio Tecnologia. 15: 42-46. 2000.  CHU C.C., WANG C.C., SUN C.S., HSU C., YIN K.C., CHU C.Y., BI F.Y.Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparaativeexperiments on the nitrogen sources. Sci Sinica 18; 659 – 668.1975.  DELLAPORTA S.L., WOOD J., HICKS J.B. A plant DNA minipreparation: version II.Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19 – 21. 1983.  DELHAIZE E, RYAN P. Update on environmental Stress: Aluminum toxicicity andtolerance in plants. Plant Physiol. 107(2):315-321. 1995.  FOX TR, COMERFORD NB, MCFEE WW. Phosphorus and aluminum release from aspodic horizon mediated by organic-acids. Soil Sci.Soc.Am.J. 54:1763-1767. SoilSci.Soc.Am.J. 54:1763-1767. 1990.  Fuente, J.M.; RAMIREZ-RODRIGUEZ, V.; CABRERA-PONCE, J.L.; HERRERAESTRELA, LAluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate syntesis.Science, v.276, p.1566-1568. .(1997).  KARTHIKEYAN, A.S.; VARADARAJAN, D.K.; D'URZO, M.P.; DAMSZ, B.RAGHOTHAMA, K.G.(2002). Regulated expression of Arabidopsis phosphatetransporters. Plant Physiology. v130, p.221-233.  KOCHIAN L. V. Cellular mechanisms of aluminum resistance in plants. Annu. Rev. PlantPhysiol.46: 237-260. 1995.  MAGNAVACA R. (1982).Genetic variability and the inheritance of aluminum tolerancein maize (Zea mays L.). Nebraska: University of Nebraska. 135 p. Tese (Doutorado emMelhoramento Genético de Plantas) - University of Nebraska.  MUCHHAL, US, PARDO JM, RAGHOTHAMA KGTranscriptional regulation of plantphosphate transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 10519-10523. 1996.  RECH, E.L.; BEM, R. de; ARAGÃO, F.J.L. Biolistic mediated gene expression in cattletissues in vivo. Brasilian Journal of Medical and Biological Research, v.29, p. 1265-1267,1996              

Análise do promotor do gene transportador de fosfato deb Arabidopsis thaliana, AtPT2, em plantas de milho transgênicas.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488069/1/Analisepromotor.pdf

Análise do promotor do gene transportador de fosfato deb Arabidopsis thaliana, AtPT2, em plantas de milho transgênicas.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa