ALVES, V. M. C.

BELELE, C. L.

CANCADO, G. M.

CARNEIRO, A. A.

CARNEIRO, N. P.

PAIVA, E.

PURCINO, A. A. C.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

TOLERÂNCIA AO ALUMÍNIO EM TABACOS TRANSFORMADOS COM OSGENES DE CITRATO SINTASE DE PLANTA E BACTÉRIA REGULADA PORPROMOTORES ESPECÍFICOS DE RAIZ E CONSTITUTIVON.P. CARNEIRO, A.A. CARNEIRO, E. PAIVA, G.M. CANÇADO, V.M.C. ALVES, C.L. BELELE, e A.A.C. PURCINO.NBA - Núcleo de Biologia Aplicada / Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo – EMBRAPA/CNPMS – Caixa Postal 151 – Rodovia MG 424, Km 65, Sete Lagoas, MG 36701-970 - cnpms@cnpms.embrapa.brPalavras chaves: tolerância ao Al, planta transgênica, citrato sintaseINTRODUÇÃOAlumínio (Al) é o metal mais abundante da crosta terrestre e sua toxicidade é um fator limitante para as plantas cultivadas em solos ácidos. O sintoma mais facilmente reconhecido na toxicidade de Al é a inhibição do crescimento da raiz e esse tem sido o método mais aceitável da medida do estresse do Al em plantas. Estratégias desenhadas para resolver esse problema incluem a calagem (aumento do pH) do solo e o uso de plantas tolerantes a solos ácidos. Um dos mecanismos mais acetáveis de plantas tolerância ao Al é o aumento da liberação pela raíz de ácidos orgânicos que quelam Al do lado externo da membrana plasmática prevenindo sua absorção. Fuente et al (1997) superexpressou o gene da citrato sintase (CS) de Pseudomonas aeruginosa em tabaco e mamão usando o promotor constitutivo CAMV35S. O gene de bacteria CS foi direcionado para o citoplasma em vez da mitocondria para evitar redistribuição de carbono da sintese de citrato para  para outros componentes do ciclo de Krebs. Esses resultados demonstraram que a superexpressão de CS conferiu as plantas de tabaco e mamão tolerância a Al.  O objetivo desse trabalho foi de isolar e clonar no vetor binário os genes CS de bactéria  (Escherichia coli) e de planta (Dauca carota) sob o controle dos promotores CAMV35 e específico de raíz. MATERIAIS E MÉTODOSOs genes CS de Daucus carota com e sem o peptideo sinal de mitocondria foram isolados por RT-PCR. O gene CS de Escherichia coli foi isolado por PCR de DNA genômico. A posição relativa dos primers do gene CS estão mostrados na Figura 1.  O promotor CAMV35S e o sitio de poliadenilação NOS foram isolados do plasmidio pCAMBIA por PCR. O promotor específico de raiz ToRB7 (S45406) foi isolado de DNA genômico de tabaco por PCR. Os primers de todas reações foram desenhados para ter sítios de enzima de restrição nas extremidades para facilitar a clonagem dos fragmentos de PCR no vetor binário. Todos os fragmentos de PCR foram clonados primeiro no vetor pTA (Invitrogen, CA, USA). Os plasmídeos recombinantes pTA foram clivados com enzima de restrição e os insertos purificados usando o kit Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, CA, USA). Os insertos purificados foram ligados no plasmídio pCAMBIA digerido com a mesma enzima usada para o plasmídio recombinante pTA. Seleções com IPTG, X-gal e kanamicina foram usadas para identificar os plasmídios pCAMBIA recombinantes contendo o primeiro inserto. Hibridizações de colonias foram usadas para identificar o segundo e terceiros fragmentos no plasmídio pCAMBIA recombinante. A presença dos inserto corretos foram confirmadas por seqüenciamento usando o seqüenciador automático ABI-PRISM 377 DNA Sequencer - Perkin Elmer. As construções gênicas estão mostradas na Figure 3.RESULTADO E DISCUSSÃOA excreção de ácido cítrico é um dos mecanismos de tolerância de plantas ao Al tóxico. Fuente et al (1997) demonstraram que plantas de tabaco e mamão transformadas com o gene de citrato sintase de Pseudomonas aeruginosa excretavam 10 vezes mais ácido cítrico no citoplasma e excluíam 4 vezes mais Al que plantas não transformadas. Nesse trabalho, nós isolamos e clonamos três diferentes genes de CS (dois de planta e um de bacteria) para comparar os efeitos dessas construções em plantas transgênicas de tabaco.  A estratégia usada nesse trabalho foi de isolar genes e promotores por PCR. Sítios de enzima de restrição foram adicionados nos finais do  primers para facilitar clonagem no vetor binário de plantas. A clonagem de insertos (genes e promotores) no vetor pTA antes da clonagem no plasmídio pCAMBIA foi usada para demonstrar que fragmentos de PCR tinham sido clivados por enzima de restrição. Esse passo adicional foi também feito para adicionar sítios de enzima de restrição nos fragmentos de PCR. Essa estratégia foi usada para clonar o promotor CAMV35S no sitio EcoRI do plasmídio pCAMBIA. As seqüências para desenhar os primers foram baseadas em seqüências depositadas no GeneBank e os sítios de restrição dos primers foram baseadas no sitio polilinker do pCAMBIA e na seqüência dos genes e promotores. A clonagem dos insertos foram confirmadas pela tamanho do fragmento nos plasmídios recombinantes clivados com enzimas de restrição (Fig. 3) e seqüenciamento. Foram usadas plantas transformadas com essas construções para comparar a tolerância no Al (Fig. 4). A secreção de ácido cítrico será quantificada por HPLC e a exclusão de íons de Al por hematoxilina. Novas construções contendo o gene da bactéria Pseudomonas aeruginosa estão sendo usadas como controle positivo. FUENTE, J.M. de la, ; RAMIREZ-RODRIGUEZ, V.; CABRERA PONCE, J.L.; HERRERA-ESTRELLA, L.J. Aluminum tolerance in transgenic plants by alteration of citrate synthase. Science, Washington, v.27, p.1566-1568, 1997.Figura 2 - A: Mapa do plasmídio pCAMBIA C2 (1303); B: Construção gênica CS; Promotores CAMV35S e ToRB7; AC: CS de Dauca carota  com peptideo sinal de mitocondria;  AD: CS de Dauca carota  sem peptídeo sinal de mitocondria;  AE: CS de Escherichia coli ;  NOS: Sítio de poliadenilação NOS ; E: EcoRI; B: BamHI; H: HindIIIFigura 3 – 1:  AC: Reação de PCR do gene CS de Dauca carota  CS com peptideo sinal (1); AD sem peptídeo sinal (2); AE E. coli  CS (3); CAMV35S (4) e ToRB7 (5) são os promotores; Sítio de poliadenilação NOS (6).Figura 3 -2: Padrão de enzima de restrição de várias construções gênica; C2 35S AC (1, 2 e 3); C2 35S AD (4, 5 e 6); ToRB7 AC (7, 8 e 9); ToRB7 AD (10; 11 e 12); C2 35S AE (13, 14 e 15) clivados com E: EcoRI; B: BamHI; H: HindIII. Figura 4 -  Atividade do GUS in plantas transgênicas de tabaco (A); Plantas de tabaco transformadas (B); Gradiente de Al (0 and 6 ppm) Placa (C):, Tubo (D); Plantas transgênicas de  tabaco crescendo em 6 ppm em teste de hematoxilina (E); Southern blot de algumas plantas transformadas; F (sonda higromicina), G (sonda factor de elongamento 1 alha); Planta controle negativo (1) e plasmídio contendo construção gênica (2).

Tolerância ao alumínio em tabacos transformados com os genes de citrato sintase de planta e bactéria regulada por promotores especificos de raiz e constitutivo.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/484016/1/Toleranciaaluminio.pdf

Tolerância ao alumínio em tabacos transformados com os genes de citrato sintase de planta e bactéria regulada por promotores especificos de raiz e constitutivo.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa