CASELA, C. R.

FAVARO, L. C.

PACCOLA-MEIRELLES, L.D.

SOUZA-PACCOLA, E.A.

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Recombinação Genética em Colletotrichum Graminicola Isoladosde Sorgo, Através da Parassexualidade_____________________________________________________________________________XXIV Congresso Nacional de Milho e Sorgo - 01 a 05 de setembro de 2002 - Florianópolis - SC_____________________________________________________________________________1Edneia A. S. P., 2Léia C. F., 3Carlos R. C. e 2Luzia D. P. M.1Departamento de Agronomia (CCA/UEL), 2Departamento de Biologia (CCB/UEL), 3EMBRAPA Milho e Sorgo (CNPMS). Correspondência para L.D Paccola-Meirelles, CCB/UEL, Caixa Postal 6001, CEP 860051-990, E-mail: paccola@uel. br Palavras – Chave: heterocário, ciclo parassexual, parameiose, mutantes IntroduçãoA antracnose causada pelo fungo Colletotrichum graminicola (Ces.) G. W. Wilson (sin. C. sublineolum P. Henn. In Kabat & Bubák) é uma das mais importantes doenças do sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) e o uso de cultivares resistentes constitui a principal medida para seu controle. Entretanto a alta variabilidade genética apresentada por C. graminicola (Ferreira et al., 1985) é um fator que dificulta o manejo da doença através da resistência genética, na medida em que esta pode ser superada pelo surgimento de novas raças na população do patógeno (Ferreira, 1988). Esser e Kuenen (1967) sugerem a heterocariose e recombinação mitótica no processo de parassexualidade como alternativas para a interação genética entre fungos. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência da parassexualidade em C. graminicola em isolados de sorgo e verificar a possibilidade de troca de material genético em plantas inoculadas com conídios mutantes.Materiais e Métodos Linhagens: Foram utilizados os mutantes previamente obtidos com luz UV e estes encontram-se descritos na Tabela 1. As linhagens selvagens e mutantes foram cultivadas meio sólido de Farinha de Aveia e Completo de Pontecorvo (Pontecorvo et al., 1953), respectivamente, sob luz contínua à temperatura de 25o C. Obtenção do heterocário: Suspensões contendo 106 conídios/mL de conídios ovais e/ou falcados de C. graminicola, provenientes de duas linhagens mutantes, portadoras de marcas nutricionais complementares, foram misturadas e inoculadas em tubos contendo 2,5 ml meio mínimo acrescido de 4% de meio completo. Após 7 dias de incubação a 25o C, a película formada foi transferida para meio mínimo sólido. Após 20 dias de crescimento a 25o C, sob luz branca fluorescente contínua foi possível observar o crescimento irregular do heterocário. Seleção e caracterização de recombinantes: Suspensões de conídios falcados provenientes do heterocário foram diluídas em solução salina 0,85% e plaqueadas em meio minímo e em meios seletivos para as marcas envolvidas no cruzamento. Heterocários que não produziram conídios falcados foram induzidos a produzir conídios ovais. Para tanto, o micélio heterocariótico foi colocado em meio mínimo líquido e mantido à 25o C por 5 dias em cultura agitada. Após o crescimento, o micélio foi filtrado e centrifugado. O pellet foi ressuspendido e a suspensão contendo esporos ovais foi plaqueada em meio mínimo e em meios seletivos para as marcas envolvidas no cruzamento. As colônias crescidas nos meios seletivos foram transferidas para meio completo em placas com 26 pontos (placas mestras). Após 10 dias de crescimento a 25o C, essas colônias foram analisadas quanto às marcas genéticas, conforme descrito por Azevedo e Costa (1973). Em cada cruzamento estimou-se o tamanho médio dos conídios falcados e ovais das linhagens parentais e dos conídios provenientes do heterocário, através de ocular micrométrica. Linhagens selvagens, mutantes e segregantes foram avaliadas quanto ao perfil eletroforético de  e  esterases, conforme descrito por Paccola-Meirelles et al. (1988). Tabela 1. Linhagens mutantes e selvagens de C. graminicola utilizadas neste estudo.(1) Todas as linhagens foram deficientes para Biotina (Bio-)(2) Os símbolos Glu-, Paba-, Piro-, Tia-, Nic- representam deficiência para biotina, ácido glutâmico, ácido p-aminobenzóico, piridoxina, tiamina e ácido nicotínico respectivamente. Os símbolos BenR e CycR representam resistência ao fungicida Benomyl e à Ciclohexamida.Teste de patogenicidade: Plantas de sorgo de 25 dias de idade foram inoculadas com suspensão de conídios falcados ou ovais (106 conídios mL-1 em água). Após o aparecimento das lesões, estas foram desinfectadas e o patógeno reisolado. A avaliação foi feita observando a presença ou ausência de lesões nas folhas das plantas. Resultados e DiscussãoFormação do heterocário: Quatro combinações entre as linhagens mutantes foram usadas para obter heterocários (243.1/2 x 243/2; 15B/42 x 243.1/2; 15B/42 x 30C/Cyc/8 e 145.2 x 30C/Cyc/8). Nem todas as linhagens mutantes esporularam (145.2 e 243.1/2) em meio sólido, o que representa uma dificuldade para a produção de heterocários e posterior seleção de segregantes. Desta forma heterocários foram formados a partir de conídios ovais produzidos em cultura líquida por esses parentais. Os conídios ovais representaram uma ferramenta útil em estudos de natureza genética nesta espécie, principalmente em linhagens com baixa ou nenhuma esporulação. O cruzamento entre os mutantes, permitiu uma avaliação da ocorrência de heterocariose na espécie. Este fenômeno é importante para os fungos uma vez que em um organismo haplóide ele permite condições similares a da diploidia mantendo uma heterozigoze. Além do mais a heterocariose pode permitir alta flexibilidade de adaptação uma vez que as relações nucleares dentro de um heterocário podem ser alteradas por mudanças no meio (Azevedo, 1976). A maioria das recombinações ocorre durante a meiose, mas, no entanto, a recombinação mitótica tem sido descrita em muitos fungos e ocupa papel importante no processo de variabilidade genética na espécie (Gu e Ko; 1998; 2000).Análise dos produtos recombinantes: Colônias originadas de conídios falcados e ovais retirados dos heterocários foram analisadas em meios seletivos, para detectar a presença de recombinantes (Tabela 2). Estes resultados demonstram a possibilidade de utilização dos dois tipos de conídios em estudos genéticos nesta espécie, principalmente em linhagens que não produzem conídios em cultura sólida. Neste trabalho foram recuperados diretamente do heterocário, aneuplóides, recombinantes haplóides e parentais. Os aneuplóides liberaram setores continuamente (Tabela 2). Este processo foi denominado por Bonatelli Jr. et al (1983), em Aspergillus niger, de parameiose para explicar um tipo de instabilidade dos núcleos diplóides heterozigotos, nos quais o processo de permuta mitótica e haploidização ocorre ainda no interior das hifas heterocarióticas, guardando semelhanças com o processo meiótico. Esse processo explica o aparecimento de colônias que setorizam com freqüência. Bagagli et al. (1990) e Paccola-Meirelles e Azevedo (1991) obteve também recombinantes haplóides e/ou aneuplóides diretamente do heterocário em Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, respectivamente. Eles observaram uma frequência alta de aneuplóides e haplóides recombinantes quando comparada com a frequência de diplóides no ciclo parassexual convencional, descrito por Pontecorvo e Roper (1952) em A. nidulans. Segundo estes autores, os diplóides quando ocorrem, são altamente instáveis e originam haplóides por não disjunção cromossômica. Esta haploidização ocorre ainda no estágio de hifa, e durante este processo, pode ocorrer permuta mitótica. Assim, as colônias que liberam setores continuamente após várias repicagens, são provavelmente aneuplóides ainda em processo de haploidização. Este processo pode representar um mecanismo natural de amplificação da variabilidade genética em fungos imperfeitos.Teste de patogenicidade: Suspensão de conídios ovais (106 conídios/ml) dos parentais 15B/42 e 243.1/2, e conídios ovais de dois segregantes deste cruzamento foram inoculados por spray em plantas de sorgo de 25 dias de idade em vasos na casa de vegetação. Os segregantes demonstraram-se mais virulentos em relação aos parentais. Após o aparecimento das lesões nas folhas, estas foram retiradas e o fungo reisolado. Estes resultados indicam uma vez mais a recombinação entre as linhagens, gerando produtos virulentos. O ciclo parassexual pode explicar diversos fenômenos incluindo a emergência de novas raças fisiológicas (Azevedo, 1976). Com a obtenção do heterocário, foi possível verificar a presença de recombinantes e sugerir a ocorrência do ciclo parassexual com parameiose nesta espécie. É uma evidencia de que a variabilidade genética de C. graminicola possa estar envolvida com o ciclo parassexual.Padrão eletroforético para esterases: Na figura 1 podem ser visualizados os padrões eletroforéticos para esterase de alguns recombinantes obtidos do cruzamento 15B/42 x 243.1/2 e 30C/Cyc/8 x 15B/42. O padrão de bandas desses segregantes permitiu evidenciar uma mistura de bandas dos tipos parentais e o surgimento de novas combinações de bandas nos recombinantes, o que confirma a heterocariose seguida de parassexualidade com parameiose nesta espécie. Figura 1. Padrão eletroforético de esterases de alguns recombinantes de Colletotrichum graminicola em gel de poliacrilamida, entre o cruzamento dos mutantes 15B/42 x 243.1/2. (P2 = Parental 2; P1 = Parental 1; Col = Colônia; Set = Setor da Colônia)Tabela 2. Número de recombinantes obtidos em cruzamentos parassexuais com parameiose de Colletotrichum graminicola isolados de sorgo.(1) As marcas Bio- Nic- correspondem a deficiência nutricional para biotina e ácido nicotínico e as marcas BenR e CycR, resistência à Benomyl e Ciclohexamida, respectivamente, BenS e CycS, suscetibilidade ao Benomyl e Ciclohexamida. * Presença de setores nas colônias. ** (P) Parentais, (R) RecombinantesConclusãoTrocas genéticas dentro da espécie de C. graminicola são possíveis, através da parassexualidade, especificamente por um mecanismo de parameiose.Literatura CitadaAZEVEDO, J. L. e COSTA, S. O. P. Exercícios práticos de genética. São Paulo: Companhia Editorial Nacional, EDUSP, 1973. AZEVEDO, J. L. Variabilidade em fungos fitopatogênicos. Summa Phytopathology, v. 2, p. 3-15, 1976.BAGAGLI, E., VALADARES, M.C.C., AZEVEDO, J. L. Parameiosis in the entomophatogenic fungus Metarhizium anisopliae. Revista Brasileira de genética, v. 14, p. 261-271, 1990.BONATELLI, Jr. R., AZEVEDO, J. L., VALENT, G. U. Parasexuality in a citric acid producing strain of Aspergillus niger. Revista Brasileira de Genética. v. 6, n. 3, p. 399-405, 1983.ESSER, K. e KUENEN, R. Genetics of Fungi. Springer Veriag. New York, 1967.FERREIRA, A. S., FREDERIKSEN, R. A., WARREN, H. L. e CARDWELL, K. L. Identification of races of Colletotrichum graminicola in Brazil. Sorghum Newsletter, v. 28, p. 80-83, 1985.Ferreira, A. S.; Casela, C. R.; Fernandes, F. T. Doenças na cultura do sorgo. In: EMBRAPA-CNPMS (EMBRAPA-CNPMS. Circular Técnica, 01), p. 53-69, 1988.GU, Y. H .e KO, W. H. Occurrence of parasexual cycle following the transfer of isolated nuclei into protoplasts of Phytophthora parasitica. Current Genetics,v. 34, n. 2, p. 120-123, 1998.GU, Y. H. e KO, W. H. Occurrence of parasexual cycle in Phytophthora parasitica following protoplast fusion. Botanical Bulletin of Academia Sinica. v.41, n. 3, p. 225-230, 2000.PACCOLA-MEIRELLES, L. D., VALARINI, M. J., Azevedo, J. L. e Alfenas, A.C. Manual de técnicas eletroforéticas em Microrganismos. Piracicaba: FEALQ. 1988, p.54.PACCOLA-MEIRELLES, L. D. e Azevedo, J. L. Parasexuality in Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate Pathology. v. 57, p. 172-176, 1991.PONTECORVO, G. e ROPER, J. A. Genetic analysis without sexual reproduction by means of  poliploidy  in Aspergillus nidulans. Journal Genetic Microbiology. 6vii, 1952.PONTECORVO, G.; ROPER, J. A.; HEMMONS, L. M., McDONALD, K. D. e BUFTON, A. W. J. The genetics of Aspergillus nidulas. Adv. Genet., v. 5, p. 141-238, 1953._____________________________________________________________________________XXIV Congresso Nacional de Milho e Sorgo - 01 a 05 de setembro de 2002 - Florianópolis - SC_____________________________________________________________________________

Recombinação genética em Colletotrichum graminicola isolados de sorgo, através da parassexualidade.

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