BOMFETI, C. A.

CARNEIRO, A. A.

CASELA, C. R.

FERREIRA, A. S.

MARRIEL, I. E.

MONTEIRO, G. G

PACCOLA-MEIRELLES, L.D.

SOUZA-PACCOLA, E.A.

UTIDA, M. K.

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Perfil Metabólico de Bactérias Isoladas de Lesões de ManchaFoliar dePhaeosphaeria em Milho, Através do Sistema BiologPrevious  Top Next  IVANILDO E. MARRIEL1, ALEXANDRE S. FERREIRA1, CARLOS R. CASELA1,MIRIAM K. UTIDA2, GISELLE G. MONTEIRO3, ANDRÉA A. CARNEIRO1,CLEIDE A. BOMFETI2, EDNÉIA A. SOUZA-PACCOLA2 e LUZIA D. PACCOLA-MEIRELLES2   1Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, Brasil; (2)UFMG/ ICB, Departamento deBotânica, 31270-901-Belo Horizonte-MG, Brasil; (3) Izabela Hendrix, Belo Horizonte,MG; 2 Universidade Estadual de Londrina, Londrina/PR .E-mail:imarriel@cnpms.embrapa.br      INTRODUÇÃO  Nos últimos anos, observou-se uma mudança acentuada na agricultura brasileira emtermos de sistema de plantio, de manejo e de intensidade de cultivo. Essas alteraçõespodem refletir na incidência de doenças que afetam a produtividade das culturas. Nacultura do milho, freqüentemente, tem sido verificada a ocorrência de uma doença foliarque apresenta, no seu estágio inicial, lesões cloróticas, tipo anasarca, tornando-senecróticas mais tarde. Esta doença foi descrita inicialmente como causada pelo fungoPhaeosphaeria maydis, f. imperf. Phyllosticta sp. (Rane et al., 1966; Fantim, 1994).  Entretanto, em função das características iniciais do sintoma dessa doença e dasdificuldades de se isolar fungos a partir de lesões anasarcas (Cervelatti et al, 2000;Paccola-Meirelles et al., 1999), o papel de um fungo como agente etiológico da doençatem sido questionado. Em 2001, Paccola-Meirelles e colaboradores isolaram uma bactériagram negativa de coloração amarela brilhante, identificada como Pantoea ananas (synErwinia herbicola), a partir de lesões jovens e evidenciaram seu papel como agente inicialdas lesões em plantas de milho sob condições controladas.  Dentre as diferentes técnicas disponíveis para a caracterização fenotípica demicrorganismos, atualmente, o sistema Biolog tem sido utilizado para diagnose debactérias fitopatogênicas gram negativas (Jones et al., 1993), baseado na reação de umasérie de 95 fontes de carbono. O desenvolvimento de cor resulta da oxidação dessasfontes de carbono distribuídas na placa, constituindo um padrão de utilização de substratochamado de perfil metabólico específico. Neste trabalho, comparou-se o perfil metabólicode bactérias predominantes em lesões anasarcas de genótipos de milho, em relação ao deoutras bactérias.   MATERIAL E MÉTODOS  Neste estudo, testaram-se 10 isolados de bactérias. Oito obtidos em trabalho dequantificação de populações bacterianas em lesões anasarcas (seis isolados), lesõesnecróticas (um isolado) e em folha assintomática (um isolado), a partir de cinco genótiposde milho (Marriel et al., 2004). Os dois isolados restantes foram obtidos de amostras desolo. O perfil metabólico dessas bactérias foi determinado através do método preconizadopor Zak et al. (1994), utilizando-se microplacas GN2 (Biolog, Inc. HAYWARD; A;USA). Cada microplaca contendo 95 fontes de carbono. As culturas bacterianas,cultivadas em caldo de soja tripcaseina (TSB), durante 48 horas sob agitação, foramcentrifugadas e ressuspendidas em solução salina, 0,85%, ajustando-se essa suspensãopara uma concentração final de 0,8 DO. Um alíquota 120 microlitros de cada suspensãodiluída foi transferida para cada cavidade das microplacas. Após a incubação de 24 horas,efetuou-se a leitura de absorbância das reações, em um leitor de placa elisa (Labstems,Multskan, MS), a 405 nm. As variáveis da diversidade metabólica estimadas e analisadasforam: índice de diversidade de Shannon (H), riqueza de substrato (S), equidade (E), e aatividade total (AT), soma da absorbância de todos substratos. Os resultados foramcomparados através de análises de variância (MSTAT-C), de cluster e de componentesprincipais (programa STATISTICA).   RESULTADOS E DISCUSSÃO   Os dados apresentados foram obtidos após um período de incubação das microplacasGN2 de 24 horas. As leituras efetuadas após 16 horas de incubação não permitiram aanálise para algumas das estirpes testadas, em particular, as bactérias isoladas de folhas demilho assintomáticas, sem lesões, e os isolados de amostras de solo, usadas comoreferências. Dos dez isolados de bactérias testados, cinco apresentavam coloraçãoamarelada brilhante e predominância absoluta nas lesões anasarcas, independente dos     genótipos. Embora ainda não identificadas, esses isolados apresentam característicassimilares às da bactéria isolada por Paccola-Meirelles et al., 2001, e identificada comoPantoea ananas.  As análises de variância mostraram diferenças significativas entre os isolados para índicede diversidade metabólica (H), diversidade de substrato (S), equidade ou índice desimilaridade (E) e atividade total. Independente desses parâmetros analisados, observou-se que os cinco isolados de bactérias amarelas (Iso 1, 2, 3, 4 e 5), predominante naslesões anasarcas e o isolado 8, de cor branca, não diferiram entre si e apresentaramvalores mais elevados para a diversidade de substratos (Figura 2), bem como para asdemais variáveis      estudadas, em relação aos outros isolados. Observa-se elevada capacidade metabólica,com o número de substratos utilizados por essas bactérias variando de 42 a 49 fontes decarbono das 95 contidas nas placas GN2. Variabilidade intra-específica e interespecíficapara diversidade funcional em populações de fitopatógenos são freqüentes (Jones et al.,1993)  Os resultados demonstram também que as estimativas de H, S, E e AT não fornecemnecessariamente informações sobre quais tipos de substratos foram utilizados pelasbactérias e devem ser analisados com cautela. Os valores próximos de 4 observados paraH, para os isolados 1, 2, 3, 4, 5 e 8, poderiam induzir a erros de interpretação, em termosde diversidade microbiana. Neste caso, os valores são explicados pela elevada capacidademetabólica dessas bactérias. Entretanto, a análise de cluster, baseado na presença eausência de substratos utilizados, via      entre as bactérias amarelas predominantes em lesões anasarcas e, em menor extensão como isolado 8, independente dos genótipos avaliados. Estudos para a identificação dessasbactérias via sequenciamento e afiliação taxonômica estão em andamento.   CONCLUSÕES  Concluiu-se que: (i) as bactérias amarelas, predominantemente isoladas a partir de lesõesdo tipo anasarca, apresentam elevada diversidade metabólica; (ii) essas bactériasdemonstram alta similaridade entre si, com relação ao perfil metabólico, independente daplanta hospedeira (iii) apresentam perfil metabólico distinto do de outras bactériasisoladas das mesmas lesões, bem como de bactérias isoladas de amostras de solo.   LITERATURA CITADA  GARLAND J. L.; MILLS, A.L. Classification and characterization of heterotrophicsmicrobial communities on the basis of patterns of community-level-sole-carbon-source-utilization. Applied and Environmental Microbiology, 57:2351-2359. 1991.  JONES J. B.; CHASE, A.R.;HARRIS, G.K. Evaluation of the biolog GN microplatesystem for idenficstion of some plant-pathogen bacteria. 77(6): 553-558.1993  MARRIEL, I.E.; FERREIRA; A. S.; CASELA; C.R., OLIVEIRA; A.C.; UTIDA, M.K.;MONTEIRO, G.G.; BOMFETI; C.A.; SOUZA-PACCOLA, E.A.; MEIRELLES, W.F.;LUZIA D. PACCOLA-MEIRELLES. Análise quantitativa e metabólica da populaçãobacteriana em lesões de mancha foliar de phaeosphaeria em milho. 2004  PACCOLA-MEIRELLES, L.D.; CASELA, C.R.; FERREIRA, A.S., MARRIEL, I.E.;MEIRELLES, W.F. Detection of a bacterium associated with a leaf spot disease of maizein Brazil. Fitopatologia Brasileira, v. 24, p.314-315, 1999.  PACCOLA-MEIRELLES, L.D., FERREIRA, A.S.; MEIRELLES, W.F.; MARRIEL,I.E.; CASELA, C.R. Detection of a bacterium associated with a leaf spot disease of maizein Brazil. Journal of Phytopatology, v. 149 p. 275-279, 2001.  RANE MS, PAYAK MM, RENFRO BL. A Phaeosphaeria leaf spot of maize In:Proceedings of the Symposia on Diseases of Rice Maize Sorghum and Millets 1966 NewDelhi India: The Indian Phytopathological Society 8-10, 1966.  ZAK, J.C.; WILLIG, M.R.; MOORHEAD, D.L.; WILDMAN, H.G. Functional diversityof microbial communities: a quantitative approach. Soil Biology and Biochemistry,26:1101-1108, 1994.               

Perfil metabólico de bactérias isoladas de lesões de manchas foliar de Phaeosphaeria em milho, através do sistema Biolog.

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