VALICENTE, F. H.

ZANASI, R. F.

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Uso de Meios Alternativos Para Produção de Bioinseticida 'a Basede Bacillus thuringiensis.Previous  Top Next FERNANDO H. Valicente e RODRIGO F. Zanasi.   Embrapa Milho e Sorgo. Caixa Postal 151,  Sete Lagoas, MG 35 701 – 970  valicent@cnpms.embrapa.br    INTRODUÇÃO:   Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram positiva, encontrada no solo, água einsetos mortos, que durante o processo de esporulação produz um cristal protéico que étóxico para insetos. As proteínas ( endotoxinas) que formam estes cristais somam entre20 a 30% da proteína total da bactéria na fase de esporulação. Os genes cry codificampara a formação destas proteínas de ação inseticida). As atividades das  endotoxinas érestrita ao trato digestivo dos insetos. O consumo de alimento tratado com endotoxinasgeralmente resulta na parada da alimentação de larvas de lepidópteros e, a paralisação dointestino que retarda a passagem de material vegetal ingerido e permite que os esporosgerminem e passem a crescer vegetativamente. Quando as larvas se alimentam com altasdoses da toxina sofrem uma paralisia geral seguida de morte. Estudos têm demonstradoque as toxinas liberadas e proteoliticamente ativadas no intestino se ligam a sítios dereceptores específicos nas membranas das células colunares do intestino médio, formandoporos que interferem com o sistema de transporte de íons da célula. Com altas doses datoxina, isto causa a lise do epitélio do intestino médio, resultando numa morte rápida.Com doses mais baixas ou em insetos menos susceptíveis, dano às células intestinais ésuficiente para parar a secreção normal do intestino, o qual abaixa o pH do lúmem epermite os esporos germinarem.  A lagarta do cartucho, Spodoptera frugiperda, é uma das principais pragas da cultura domilho no Brasil. O ataque deste inseto pode reduzir a produção de grãos em até 34%,sendo o controle feito essencialmente com inseticidas químicos. O ciclo de vida desteinseto é completado em 30 dias em condições de laboratório e, o número de ovos podevariar de 100 a 200 por postura/fêmea, sendo que um total de 1500 a 2000 ovos pode sercolocado por uma única fêmea. Assim, percebe-se o potencial de dano que este insetopode causar no campo. O Bt pode se tornar uma alternativa viável e econômica paracontrole desta praga, evitando a contaminação do meio ambiente, de aplicadores e mortede inimigos naturais.  Esta bactéria pode ser cultivada em meio sólido, líquido e semi-sólido. O uso de produtosou subprodutos (água de milho, vinhaça, arroz, água de beterraba, fubá, farinha e/oufarelo de soja) para produção deste patógeno é uma alternativa viável e econômica. Estetrabalho teve como objetivo testar produtos alternativos na forma líquida e sólida comomeio alternativo de cultivo de Bt.   MATERIAL E MÉTODOS:   Foram realizados bioensaios com meios alternativos líquidos e sólidos para o cultivo doBt. No primeiro bioensaio, foi usada a cepa 344 (Bacillus thuringiensis tolworthi) doBanco de Microorganismos da Embrapa Milho e Sorgo. Para cada litro de água foramadicionados 5g de farinha de soja e 15g de glucose de milho. Os tratamentos utilizadosneste experimento foram: T1- o meio foi fervido e com agitação constante, T2- meiofervido e sem agitação, T3- meio não fervido e com agitação constante, T4- meio nãofervido e sem agitação e T5- testemunha – água mais Bt com agitação. Para ostratamentos 1 e 2, o meio foi fervido em uma chapa aquecedora por 2 minutos e depoisdeixado em temperatura ambiente. Quando o meio atingiu a temperatura deaproximadamente 30oC, este foi inoculado com o Bt (cepa 344) previamente crescido emmeio líquido e estéril, agitado por 4 dias a 30oC. Para os tratamentos 3 e 4 o material foiinoculado em temperatura ambiente e, somente o tratamento 3 foi agitado. A agitaçãopara todos os tratamentos foi de 180rpm. As lagartas sadias, provenientes da criaçãoartificial, utilizadas nos bioensaios tinham dois dias de idade e, para cada tratamentoforam usadas as concentrações de 106, 107 e 108 esporos/ml, sendo o material colocadosobre a dieta artificial e fornecido aos insetos. A mortalidade foi avaliada diariamente.  No segundo bioensaio foi usado arroz autoclavado (esterilizado) e as cepas T09 e 344(Bacillus thuringiensis tolworthi) e a cepa 1644 (coletada em amostra de solo mas aindanão identificada). Foram usados 50 e 100 gramas de arroz autoclavado e inoculados com20 mL e 40 mL da bactéria em forma líquido e estéril contendo as cepas de Bt. Depois de5 dias a 30oC em estufa, o arroz foi lavado 3 vezes com água, sendo o líquido resultantediluído para contagem de esporos. Larvas sadias de 2 dias de idade foram usadas para osbioensaios, sendo mantidas em recipientes plásticos de capacidade de 50mL. A avaliaçãode mortalidade foi feita diariamente.  No terceiro bionsaio foram usados 50 e 100 gramas de arroz mais glucose de milho efarelo de soja. Depois da mistura ter sido esterilizada, foi inoculada com 20mL(para 50gramas) e 40 mL (para 100 gramas) de um fermentado líquido contendo a cepa T09. Oarroz inoculado foi mantido a 30oC por 5 dias em estufa. As lagartas testadas tinham 2dias de idade e eram provenientes da criação artificial. A mortalidade foi avaliadadiariamente.  Um quarto bioensaio foi realizado usando 50 e 100 gramas de arroz esterilizado, usandosomente 20 mL de inóculo da cepa T09, 344 e 1644. As cepas de Bt foram crescidaspreviamente em meio líquido por 4 dias a 30oC. Este material foi usado na inoculação dearroz esterilizado e deixado a 30oC por 5 dias. Após este período, o material foi lavadocom água por 3 vezes e o líquido resultante, foi diluído para obtenção de uma série deconcentrações que foram utilizadas no teste de mortalidade contra a lagarta do cartucho.  O meio de cultura padrão usado foi o meio LB mais sais (MgSO4, FeSO4, ZnSO4 eMnSO4 ).   RESULTADOS E DISCUSSÃO:      O primeiro bioensaio foi repetido duas vezes e mostrou que a maior mortalidade foicausada pelo material fervido e agitado constantemente, na concentração de 108esporos/ml (100% de mortalidade) para o primeiro bioensaio e mortalidade de 100% naconcentração de 109 esporos/mL. A produção de esporos máxima variou de 4 x 108esporos/mL a 1.5 x 109 esporos/mL. Os outros tratamentos, exceto a testemunha,chegaram a matar até 80%. O custo por hectare da glucose de milho mais farinha de sojaem meio líquido, fica em R$ 0, 08 (oito centavos).  O uso de 100g de arroz não aumentou a produção final de esporos e todos os tratamentoscresceram até o máximo de 4 x 108 esporos/ml. A mortalidade também atingiu 100% daslarvas para as concentrações mais altas. O custo de produção de Bt em arroz é deaproximadamente R$0,08, dependendo do tipo do arroz escolhido.     Os resultados do segundo bioensaio mostraram que a produção de esporos atingiu ummáximo de 4 x 108 esporos/mL, independentemente da cepa utilizada. A mortalidadeatingiu 100% das larvas testadas para a concentração mais alta e as cepas T09 e 344apresentaram mortalidade acima de 90% na concentração de 107 esporos/ml.  O terceiro bioensaio mostrou que a adição de glucose de milho e farinha de soja ao arrozautoclavado durante o processo de crescimento do Bt aumentou a produção final para 1.4x 109 esporos/ml. Entretanto, o uso de 100 gramas de arroz não correspondeu a esteaumento, sendo a produção final a mesma quando se usa 50 e 100 gramas de arroz. Amortalidade foi alta para a dose mais alta em cada tratamento.  Os resultados do quarto bioensaio mostraram que a produção final de esporos foi amesma (entre 3 e 4 x 108 esporos/ml), tanto para 50 e 100 gramas de arroz, o que mostraque com o uso de 50 gramas tem-se economia da metade do material usado. Amortalidade foi máxima (100%) para as doses mais altas, para a maioria das cepasutilizadas (tabela 1).     Dos meios testados, o meio líquido descrito no primeiro bioensaio e o meio de arrozmais glucose de milho mais farinha de soja, são os meios mais eficientes na produçãodeste biopesticida. Estes resultados mostram que se pode produzir o Bt em meiosalternativos e baratos, que podem ser usados tanto por pequenos, médios e grandesprodutores rurais. A grande vantagem destes métodos é que a maioria deles pode serexecutado dentro da própria fazenda. Para isto, basta ter o inóculo mantido em ambienteestéril.          LITERATURA CITADA   Aronson, A.E, E.S. Han, W. McGaughey & D. 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Uso de meios alternativos para produção de bioinseticida a base de Bacillus thuringiensis.

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